钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，该技术可直接应用于羊及其他动物肌肉的生物化学研究。
【背景技术】
[0002]医学等生命科学研究领域通常是通过同位素标记法检测生物体内钙蛋白酶的磷酸化水平，但同位素标记检测的方法繁琐，且对人体的潜在伤害很大。但是，对于磷酸化钙蛋白酶的生化变化进行研究分析，以及对其他动物肌肉生理生化的研究来说，钙蛋白酶的磷酸化是科学研究中必不可少的。虽然现有技术中也有针对蛋白酶磷酸化水平测定的较为安全的方式，但是由于钙蛋白酶较为敏感，极易受外界环境影响，导致活性降低甚至失活等特性。故此，目前还没有专门针对钙蛋白酶磷酸化水平检测的方法。因此，一种对人体安全、检测快速准确地测定钙蛋白酶的磷酸化的方法是亟需的。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0004]本发明还有一个目的是提供一种钙蛋白酶粗样品的提取方法，通过本发明的组织裂解液提取的蛋白样品中钙蛋白酶的含量较高、活性较高，解决了在磷酸化水平测定过程中钙蛋白酶容易部分失活或全部失活的问题。
[0005]本发明再有一个目的是提供一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，本发明通过利用蛋白免疫沉淀和蛋白免疫技术实现了对钙蛋白酶磷酸化水平的测定，解决了现有方法中测定磷酸化水平时对人体危害较大和操作过程繁琐等问题。
[0006]本发明提供的技术方案为:
[0007]一种钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法，包括:
[0008]步骤一、将含有钙蛋白酶的蛋白样品的蛋白浓度调至5.83?12.5 μ g/ μ 1，之后向其中加入磷酸化抗体，所述磷酸化抗体与所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中的蛋白的总反应量的质量比为1:1750?2500，然后将含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4°C下震荡孵育，以形成免疫复合物，再通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到磷酸化的钙蛋白酶样品；以及，
[0009]步骤二、通过蛋白质免疫印迹方法检测所述步骤一中得到的所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平。
[0010]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，通过蛋白质免疫沉淀方法富集得到所述磷酸化的钙蛋白酶样品的具体步骤包括:
[0011]1.1)取Protein A/G琼脂糖树脂楽液并使其吸附在离心柱上，其中，所述ProteinA/G琼脂糖树脂浆液与所述钙蛋白样品的体积比为2?3:40?60，且每个离心柱内加入的所述Protein A/G琼脂糖树脂浆液的体积为20-30 μ 1 ;
[0012]1.2)将所述免疫复合物加入经过步骤1.1)处理后的吸附有所述Protein A/G琼脂糖树脂的所述离心柱中，并于4°C恒温震荡孵育lh，之后离心，然后使用IP洗涤缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂三次，再用IP条件缓冲液洗涤所述Protein A/G琼脂糖树脂一次，最后所述离心柱上截留的即为钙蛋白酶、磷酸化抗体和Protein A/G琼脂糖树脂的三元复合物；和，
[0013]1.3)向步骤1.2)中截留有所述三元复合物的所述离心柱中添加还原性上样缓冲液，并于100°C下孵育5min，冷却后在室温下lOOOOXg离心lmin，所得的流穿液体即为富集的所述磷酸化的钙蛋白酶样品。
[0014]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述钙蛋白酶反应的第一抗体采用μ -calpain单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为1.4-2 μ g/ml。
[0015]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤二中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的钙蛋白酶样品的磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用ant1-mouse IgG，所述第二抗体的浓度为0.1-0.3 μ g/ml。
[0016]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，在所述步骤一之前还包括提取所述含有钙蛋白酶的蛋白样品的方法:
[0017]采集动物肌肉样品，并按照质量体积比1:6将所述动物肌肉样品加入组织裂解液或者肌浆抽提液中，将所述动物肌肉样品和所述组织裂解液于冰上匀浆至所述动物肌肉样品和所述组织裂解液形成均一的匀浆液，然后将所述匀浆液于4°C下离心收集上清液即得到所述含有钙蛋白酶的蛋白样品；且所有步骤均在冰上操作或冰浴操作；
[0018]其中，所述组织裂解液包含浓度为25mM的N- 二甘氨酸和150mM的氯化钠，所述组织裂解液的pH为7.6 ;
[0019]所述肌浆抽提液包含浓度为lOOmM的Tris base、10mM的EDTA和0.05%的巯基乙醇，所述肌浆抽提液的pH为8.3。
[0020]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述组织裂解液中还包含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，且所述磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂均需现用现加；
[0021]所述匀浆过程在冰上共进行30s，且每次匀浆时间为10s，每两次匀浆之间间隔20so
[0022]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述磷酸化抗体和所述含有该蛋白酶的蛋白样品的总体积为400-600 μ 1，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品中蛋白的总反应量为3500-5000 μ go
[0023]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述磷酸化抗体的浓度为0.2-0.3 μ g/ μ 1，所述磷酸化抗体采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸泛抗单克隆抗体。
[0024]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述步骤一中，所述含有钙蛋白酶的蛋白样品与磷酸化抗体于4°C下震荡孵育2_14h，以形成所述免疫复合物。
[0025]优选的是，所述的钙蛋白酶磷酸化水平的测定方法中，所述动物肌肉样品取自羊。
[0026]本发明至少包括以下有益效果:
[0027]本发明的方法通过蛋白质免疫沉淀和免疫印迹技术同样可以在宰后肌肉中检测出磷酸化的钙蛋白酶，所需的肌肉样品量少，操作过程较为简单，重复性好，检测所得条带清晰，试验方法对人体的潜在伤害小，是一种高效测定宰后肌肉中μ -calpain磷酸化水平的方法。利用该方法可对羊骨骼肌中磷酸化钙蛋白酶的生化变化进行研究分析，也可延伸至其他动物肌肉生理生化的研究。
[0028]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例1中4-氯-1-萘酚显色法后的成像图；
[0030]图2为本发明实施例2中ECL显色法后的曝光成像图；
[0031 ]图3为本发明实施例2中的ECL显色法后的PVDF膜成像图；
[0032]图4为本发明实施例3中的ECL显色法后的曝光成像图；
[0033]图5为本发明实施例4中的ECL显色法后的曝光成像图；
[0034]图6为本发明实施例5中的ECL显色法后的曝光成像图；
[0035]图7为本发明实施例5中曝光成像图的Quantity One软件分析图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0037]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0038]本发明中用到的试剂和试剂盒:
[0039]组织裂解液:25mM N_ 二甘氨酸，150mM氯化钠，添加磷酸酶抑制剂(Roche，每10ml添加1片)和蛋白酶抑制剂(Roche，每50ml添加1片)，pH 7.6 ;
[0040]肌浆抽提液:lOOmMTris base，10mM EDTA，0.05%巯基乙醇，ρΗ8.3[0041 ]磷酸化抗体:phospho-Ser/Thr/Tyr antibody, Abeam abl5556:
[0042]2X 还原性上样缓冲液:10% SDS 4mL，甘油 2mL，0.5M Tris-HCl pH6.82mL，1M DTT2.0mL，溴酸蓝 0.0lg:
[0043]8% 的分离胶:双蒸水 4.68ml，1.5M Tris-Hcl pH8.82.5ml, 10% SDS 100 μ 1，30% Acr-Bis(37.5:1)2.67ml，TEMED 5 μ 1，10%过硫酸铵 50 μ 1 ；
[0044]4% 的浓缩胶:双蒸水 3.05ml，0.5Μ Tris-HCl (pH6.8) 1.25ml, 10 % SDS 50 μ 1,30% Acr-Bis(37.5:1)0.65ml，TEMED 5 μ 1，10%过硫酸铵 25 μ 1 ；
[0045]TBS 缓冲液:Tris 1.21 lg，NaCl 8.76g，lmol/L 的 HC1 调 pH 至 7.5 ;
[0046]封闭液中包含:TBS50ml/L，Tween2025 μ 1/L，BSA 1.5g/L:
[0047]TBST1:每 500mLTBS 加 0.5mL Tween20 ；
[0048]