专利名称：一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法
技术领域：
本发明涉及的是酶学与酶技术领域，具体涉及一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法。
背景技术：
葡聚糖是一类非淀粉类多糖，它是由β-1，3-葡萄糖苷键和/或β-1，6_葡萄糖苷键以及少量的β-1，4-葡萄糖苷键组成的链状多糖，是真菌和植物细胞壁的重要组成成分。大量的化学和药理分析表明，富含葡聚糖的真菌多糖(如灰树花多糖、香菇多糖)具有明显的抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、调节血糖、降血压等作用。葡聚糖合成酶对 β-葡聚糖的合成具有至关重要的作用。目前，该酶活力的检测方法中大都是以UDP-[14c] 葡萄糖为底物，通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的变化来测定 β-葡聚糖合成酶的活力，这类方法需要昂贵的底物(udp-[14c]葡萄糖)和检测仪器，实验成本高，而且放射性底物udp-[14c]葡萄糖具有明显的危害性，所以这类方法很难被广泛应用。本发明以葡萄糖为底物、用3，5-二硝基水杨酸作为显色剂来测定β -葡聚糖合成酶的活力。该方法不受磷酸盐缓冲液的干扰，所得酶浓度曲线与酶促反应速度在较宽的酶浓度范围内呈线性相关。该法不需要昂贵的仪器，大大节省了实验成本，而且该方法使用不含有放射性的葡萄糖作为底物，安全性高，便于大规模推广应用。
发明内容
针对已有技术的缺点，本发明提供一种测定葡聚糖合成酶活力的方法，该方法以葡萄糖为底物、用3，5-二硝基水杨酸作为显色剂来测定葡聚糖合成酶的活力。该方法与使用UDP-[14C]葡萄糖为底物、通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的变化来测定葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大大降低实验成本，而且该方法使用不含有放射性的葡萄糖作为底物，实验的安全性高。本方法灵敏度高，操作简单安全，方便快捷。该测定β -葡聚糖合成酶活力的方法包括以下工艺步骤(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取1.0-5. Og β-葡聚糖合成酶，加入 50-100ml 7. Ommol/L NaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸盐缓冲液搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. Olg/ ml-0. lg/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml, 不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热；冷却至室温后，用蒸馏水定容至1000ml， 过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存；室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月；(4)葡萄糖溶液标准曲线的制作分别取6-15组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液2. 0ml，浓度范围在0_500 μ g/ml 之间，加入DNS试剂1. 5ml，沸水浴加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510-570nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的光密度值之间的关系，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白(Img)具有的酶活力单位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力，单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，μ g ；T——反应时间，min;M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定将终浓度为l_5mg/ml的预热至测定温度的葡萄糖溶液加入到预热至相应温度的 β -葡聚糖合成酶溶液中开始合成反应，反应温度为10-40°C，反应时间为60min以内，将该酶促反应液与1. 5ml的DNS溶液迅速混合后于沸水中加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510-570nm处测定光密度值，根据步骤(4)制作的葡萄糖浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖合成酶在合成β-葡聚糖反应中单位时间内所消耗的葡萄糖的含量，代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式， 计算出β-葡聚糖合成酶的活力。上述β -葡聚糖合成酶溶液以pH = 7. 0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液作为溶剂。上述测定光密度值的最佳波长为MOnm。本发明的优点是本发明以葡萄糖作为酶促反应底物，用3，5-二硝基水杨酸作为显色剂对葡聚糖合成酶合成葡聚糖后消耗的葡萄糖的量在可见光下进行检测来确定葡聚糖合成酶的活力。该方法与使用UDP-[14C]葡萄糖为底物、通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的变化来测定葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大大降低实验成本，而且该方法使用不含有放射性的葡萄糖作为底物，实验的安全性高。本方法灵敏度高，操作简单安全，方便快捷。便于大规模推广应用。本发明可广泛用于糖类与酶类产品的研究与开发中。
具体实施例方式以下介绍详细本发明的实施例。实施例1 主要仪器数显电热恒温水浴锅，HH-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司。(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取1. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. 02g/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明，再逐步加入四水酒石酸钾钠91. Og、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 IOOOml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月；(4)葡萄糖溶液标准曲线的制作分别取6组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液2. 0ml，浓度范围在0_500 μ g/ml之间，加入DNS试剂1. 5ml，沸水浴加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长 510-570nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖浓度与测得的光密度值之间的关系，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中X——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，μ g ；T-反应时间，min ；M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定取1. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin，加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液1. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β -葡聚糖合成酶浓度，可以将待测的葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为 60min以内，迅速加入1. 5mlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后于540nm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量，代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，即可计算出β -葡聚糖合成酶的活力。实施例2 主要仪器数显电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司。(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取2. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. 04g/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 IOOOml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月；(4)葡萄糖标准曲线的制作分别加入6组不同浓度的葡萄糖标准溶液4. 0ml，加入DNS试剂3. 0ml，混勻，于沸水浴中加热5min，取出，冷却，用蒸馏水定容至50ml，于波长540nm波长下测定光密度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应光密度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，μ g ；T——反应时间，min ；M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定取2. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin， 加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液2. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β -葡聚糖合成酶浓度，可以将待测的β -葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为30min以内，迅速加入3. OmlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至 50ml，于MOnm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的β-葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量， 代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。实施例3:主要仪器数显电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司。(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取5. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4,pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. lg/ml，4°C保存备用；。(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 IOOOml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月；(4)葡萄糖标准曲线的制作分别加入6组不同浓度的葡萄糖标准溶液6. 0ml，加入DNS试剂4. 5ml，混勻，于沸水浴中加热5min，取出，冷却，用蒸馏水定容至75ml，于波长540nm波长下测定光密度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应光密度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，μ g ；T-反应时间，min ；M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定取3. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin， 加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液3. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β -葡聚糖合
8成酶浓度，可以将待测的β -葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为30min以内，迅速加入4. 5mlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至 75ml，于MOnm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的β-葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量， 代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。实施例4 主要仪器数显电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司。(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取5. Og β -葡聚糖合成酶，加入IOOml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. 05g/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 IOOOml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月；(4)葡萄糖标准曲线的制作 分别加入6组不同浓度的葡萄糖标准溶液8. Oml，加入DNS试剂6. Oml，混勻，于沸水浴中加热5min，取出，冷却，用蒸馏水定容至100ml，于波长540nm波长下测定光密度值； 每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应光密度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β -葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，Pg;T——反应时间，min;M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定取4. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin，加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液4. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β-葡聚糖合成酶浓度，可以将待测的β -葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为30min以内，迅速加入6. OmlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至 100ml，于510nm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量， 代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。实施例5:主要仪器数显电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司；(1)制样——β-葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取4. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. 08g/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 IOOOml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月；(4)葡萄糖标准曲线的制作分别加入6组不同浓度的葡萄糖标准溶液10. 0ml，加入DNS试剂7. 5ml，混勻，于沸水浴中加热5min，取出，冷却，用蒸馏水定容至125ml，于波长MOnm波长下测定光密度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应光密度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，Pg;T——反应时间，min;M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ； (7) β -葡聚糖合成酶活力的测定
取5. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin， 加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液5. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β -葡聚糖合成酶浓度，可以将待测的β -葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为30min以内，迅速加入7. 5mlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至 125ml，于570nm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的β-葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量， 代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。实施例6:主要仪器数显电热恒温水浴锅，ΗΗ-4型，河南智诚科技发展有限公司；便携式防水型pH/mV/°C测定仪，HI8424型，HANNA instruments ；可见分光光度计，723型，上海精密科学仪器有限公司。(1)制样——β -葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取3. Og β -葡聚糖合成酶，加入50ml磷酸盐缓冲液(7. Ommol/LNaH2PO4, 7. Ommol/L Na2HPO4, pH = 6. 8)搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. 06g/ml，4°C保存备用；(2)葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ml的葡萄糖标准溶液；(3) DNS溶液的配制称取3，5- 二硝基水杨酸3. 15g(AR)，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C ；然后逐步加入IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. Og、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解；停止加热，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 1000ml ；过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用，有效期为6 个月。(4)葡萄糖标准曲线的制作分别加入6组不同浓度的葡萄糖标准溶液12. 0ml，加入DNS试剂9. 0ml，混勻，于沸水浴中加热5min，取出，冷却，用蒸馏水定容至150ml，于波长MOnm波长下测定光密度值；每个浓度做三个平行样；根据每组葡萄糖溶液浓度与测得的相应光密度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；(5) β -葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；(6) β-葡聚糖合成酶的比活力的计算β -葡聚糖合成酶的比活力计算公式X = W/(TXM)式中Χ——酶的比活力单位，U/mg ；W——反应掉的葡萄糖的质量，Pg;T——反应时间，min;M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；
(7) β -葡聚糖合成酶活力的测定取6. Oml葡萄糖溶液(lmg/ml)于25ml试管中，于25°C恒温水浴中预热lOmin， 加入待测的β -葡聚糖合成酶溶液6. Oml进行合成反应，为确定合适的待测β -葡聚糖合成酶浓度，可以将待测的β -葡聚糖合成酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，反应时间为30min以内，迅速加入9. OmlDNS试剂于沸水中加热5min，冷却至室温后用蒸馏水定容至 150ml，于540nm处测定光密度值，根据上一步骤制作的葡萄糖浓度与测得的相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测的β-葡聚糖合成酶的合成反应消耗掉的葡糖糖的量， 代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。本发明不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种测定葡聚糖合成酶活力的方法，包括以下工艺步骤 ⑴制样——β-葡聚糖合成酶溶液的制备准确称取1. 0-5. Og β-葡聚糖合成酶，加入50-100ml 7. 0 mmol/L NaH2PO4, 7.0 mmol/L Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸盐缓冲液搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0. Olg/ ml-0. lg/ml，4°C保存备用； ⑵葡萄糖标准溶液的配制精确称取IOOmg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1. Omg/ ml的葡萄糖标准溶液；⑶DNS溶液的配制称取3，5-二硝基水杨酸3. 15g，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45°C;然后逐步加入 IOOml 0. 2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91. 0g、苯酚2. 50g和无水亚硫酸钠2. 50g ；继续45°C水浴加热，同时补加水300ml, 不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热；冷却至室温后，用蒸馏水定容至1000 ml, 过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存；室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月； ⑷葡萄糖溶液标准曲线的制作分别取6-15组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液2. 0ml，浓度范围在0-500 μ g/ml 之间，加入DNS试剂1. 5ml，沸水浴加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510-570nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的光密度值之间的关系，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；(5)葡聚糖合成酶的活力单位β -葡聚糖合成酶的活力单位(U)被定义为每分钟消耗1 μ g葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力(U/mg)定义为单位酶蛋白(Img)具有的酶活力单位；(6)葡聚糖合成酶的比活力的计算 β-葡聚糖合成酶的比活力计算公式X= W/ (TXM)式中Χ——酶的比活力，单位，U/mg ； W——反应掉的葡萄糖的质量，μ g ； T——反应时间，min ；M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml ；(7)葡聚糖合成酶活力的测定将终浓度为l_5mg/ml的预热至测定温度的葡萄糖溶液加入到预热至相应温度的 β -葡聚糖合成酶溶液中开始合成反应，反应温度为10-40°C，反应时间为60min以内，将该酶促反应液与1. 5ml的DNS溶液迅速混合后于沸水中加热5-20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510-570nm处测定光密度值，根据步骤(4)制作的葡萄糖浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测β-葡聚糖合成酶在合成β-葡聚糖反应中单位时间内所消耗的葡萄糖的含量，代入步骤(6)中葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出葡聚糖合成酶的活力。
2.根据权利要求1所述的测定葡聚糖合成酶活力的方法，其特征是上述测定 β -葡聚糖合成酶活力的方法是以葡萄糖为酶促反应的底物，用3，5- 二硝基水杨酸作为显色剂来测定葡聚糖合成酶活力。
3.根据权利要求1所述的测定葡聚糖合成酶活力的方法，其特征是所述步骤(7) 中β -葡聚糖合成酶溶液以7. 0 mmol/L NaH2PO4- Na2HPO4, pH = 6. 8的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液作为溶剂。
4.根据权利要求1所述的测定葡聚糖合成酶活力的方法，其特征是所述步骤(7) 中测定光密度值的最佳波长为^Onm。
全文摘要
本发明公开了一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法，本发明的优点是以葡萄糖作为酶促反应底物、用3,5-二硝基水杨酸作为显色剂对β-葡聚糖合成酶合成β-葡聚糖后消耗的葡萄糖的量在可见光下进行检测来确定β-葡聚糖合成酶的活力。该方法与传统的使用UDP-[14C]葡萄糖为底物、通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的变化来测定β-葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大幅度降低实验成本，而且该方法不使用含有放射性的葡萄糖作为底物，实验的安全性高。本方法灵敏度高，操作简单安全，方便快捷，便于大规模推广应用。本发明可广泛用于糖类与酶类产品的研究与开发中。
文档编号C12Q1/48GK102443621SQ20111038969
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者丁金聚, 侯启昌, 古亚楠, 孟甜甜, 崔羽佳, 张鹏, 朱奎成, 李鹏, 王卫国, 赵永亮 申请人:河南工业大学, 王卫国