一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶生产的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，一种提高真菌降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半 纤维素酶的方法，涉及5个基因（五个转录因子基因分别为NCU05064、NCU03699、NCU02576、 NCU06186、NCU08744)。
【背景技术】
[0002] 纤维素是自然界中存在最广泛、最丰富的碳水化合物。随着地球资源的快速消耗、 环境污染和能源危机的日益加剧，纤维素作为潜力巨大、环境友好的可再生能源成为研究 的重点。作为地球上数量最大的可再生资源，纤维素的利用效率却远远低于社会发展的要 求，若能将其高效地转化为可利用的能源、食料和化学原料等，势必将会对人类社会的健康 发展起到关键作用。要利用这些储量巨大的生物质资源，需要糖化和发酵两个基本步骤。其 中，如何将生物质高效地水解为单体化合物（葡萄糖、木糖等）已成为其利用过程中的一个 迫切需要解决的问题。
[0003] 多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，特别是子囊菌和担子菌等丝状真菌 可以分泌多种木质纤维素水解酶，与其它微生物相比，其具有完整的纤维素酶系，这种特性 使其成为研究纤维素利用和纤维素酶生产过程中的热点。在提高生物质降解效率的研究 中，传统诱变技术已经取得了重大进步，提升空间有限。
[0004] 因此，本领域迫切需要开发能够提高纤维素酶生产从而提供菌株对纤维素利用的 技术和方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种提高木质纤维素降解及纤维素酶、半纤维素酶表达的方 法及其应用。
[0006] 本发明第一方面，提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达、和/ 或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：
[0007] 抑制丝状真菌的纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的表达和/或活性，从而 提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性。
[0008]在另一优选例中，所述的丝状真菌包括：脉孢菌（Neurospora)、或侧孢霉 (Sporotrichum)〇
[0009]在另一优选例中，所述的丝状真菌还包括曲霉（Aspergillus)、木霉 (Trichoderma)、青霉（Penicillium)、鎌刀霉（Fusarium)、或毁丝酶（Myceliophthora)。
[0010] 在另一优选例中，所述纤维素降解相关锌指转录因子包括：
[0011] (a)SEQ ID N0. :1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种。
[0012] 在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子还包括：
[0013] (b)与SEQ ID N0. :1、3、5、7、或9所示序列同源性为50%以上，较佳地为60%以 上，更佳地为65%以上的纤维素降解相关锌指转录因子。
[0014] 在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的纤维素降解相关锌指转录 因子的表达和/或活性。
[0015] 在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子至少包括SEQ ID N0. :1所 示的序列。
[0016] 在另一优选例中，所述的丝状真菌为脉胞菌，较佳地，为粗糙脉胞菌。
[0017] 本发明第二方面，提供了一种纤维素降解相关锌指转录因子或其基因的抑制剂的 用途，（a)用于提高丝状真菌纤维素和/或半纤维酶的表达；和/或（b)用于提高丝状真菌 的纤维素降解活性。
[0018] 在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子包括选自（a)SEQ ID NO. :1、3、5、7、或9所示序列的一种或多种；或（b)与SEQ ID NO. :1、3、5、7、或9所示序列 同源性为50%以上，较佳地为60%以上，更佳地为65%以上的纤维素降解相关锌指转录因 子。
[0019] 在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子的NCBI参考序列号 包括：XP_ 6626〇7. 1、XP_659104. 1、CBFS4793. 1(曲霉）；EPS3〇〇56. 1、EPS：31562. 1、 EPS26047. 1 (青霉）；XP_006965567. 1、XP_006967595.、ETS00557. 1 (木霉）；EWZ01503. 1、 ENH63019. 1、EXA00009. 1 (镰刀霉）；XP_003665650. 1、XP_003662015. 1、XP_003658871. 1、 XP_003662960. 1 (毁丝酶）。
[0020] 在另一优选例中，所述的抑制剂包括所述纤维素降解相关锌指转录因子的抗体、 抑制性mRNA、反义RNA、microRNA(miRNA)、siRNA、shRNA以及锌指转录因子的活性抑制剂。
[0021] 本发明第三方面，提供了一种用于降解纤维素的工程菌，所述工程菌中纤维素降 解相关锌指转录因子被敲除或被下调。
[0022] 在另一优选例中，所述的工程菌不表达或基本不表达纤维素降解相关锌指转录因 子。
[0023] 在另一优选例中，所述的"基本不表达"指的是与野生型菌株相比，所述工程菌纤 维素降解相关锌指转录因子的表达量至少降低了 50%，较佳地，至少降低了 60%、70%、 80%、或 90%。
[0024] 在另一优选例中，与野生型菌株相比，所述工程菌纤维素酶和/或半纤维素酶的 表达量和/或活性至少提高了 20%，较佳地，至少提高了 50-80%，更佳地，至少提高了 100-500%。
[0025] 在另一优选例中，所述的纤维素降解相关锌指转录因子包括选自SEQ ID N0. :1、 3、5、7、或9所示序列的一种或多种。
[0026] 在另一优选例中，所述工程菌包括改造自以下野生菌的菌株：脉孢菌 (Neurospora)、或侧抱霉（Sporotrichum)、曲霉（Aspergillus)、木霉（Trichoderma)、青霉 (Penicillium)、鎌刀霉（Fusarium)、或毁丝酶（Myceliophthora)。
[0027] 本发明第四方面，提供了一种生产纤维素酶和/或半纤维素酶的方法，在纤维素 原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，并从培养物中分离提纯所述的纤维素 酶和/或半纤维素酶。
[0028] 在另一优选例中，所述的诱导物即纤维素原料包括木质纤维素、结晶纤维素、木聚 糖、木质纤维素水解物、木寡糖、纤维寡糖、木糖、或阿拉伯糖。
[0029] 本发明第五方面，提供了一种降解纤维素并获得纤维素降解产物的方法，在木质 素原料的存在下，培养本发明第三方面所述的工程菌，从而降解木质素并获得木质素降解 产物。
[0030] 本发明第六方面，提供了本发明第三方面所述工程菌的用途，用于制备纤维素酶 和/或半纤维素酶、和/或用于提高纤维素的降解。
[0031] 该方法是利用敲除或突变锌指转录因子基因的微生物菌株降解木质纤维 素或是生产纤维素酶、半纤维素酶的方法，所述微生物为脉孢菌（Neurospora)、曲霉 (Aspergillus)、木霉（Trichoderma)、青霉（Penici Ilium)、鎌刀霉（Fusarium)或侧抱霉 (Sporotrichum)〇
[0032] 所述锌指转录因子基因包括 NCU05064、NCU03699、NCU02576、NCU06186 和 NCU08744,敲除其中的任意转录因子，或突变任意一个转录因子的部分碱基，或是减弱任意 一个转录因子的表达。
[0033] 所述锌指家族转录因子基因NCU05064的核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码 序列表中序列1所不蛋白；所述锋指家族转录因子基因NCU03699的核昔酸序列如序列表中 序列4所不，编码序列表中序列3所不蛋白；所述锋指家族转录因子基因NCU02576的核昔 酸序列如序列表中序列6所示，编码序列表中序列5所示蛋白。所述锌指家族转录因子基 因NCU06186的核苷酸序列如序列表中序列8所示，编码序列表中序列7所示蛋白。所述锌 指家族转录因子基因NCU08744的核昔酸序列如序列表中序列10所不，编码序列表中序列 9所示蛋白。
[0034] 具体的，该方法利用以下任一菌株：以脉孢菌（Neurospora)为出发菌株构建的 部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU05064基因的菌株；以脉孢菌（Neurospora)为 出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU03699基因的菌株；以脉孢菌 (Neurospora)为出发菌株构建的部分碱基突变或敲除或减弱转录因子NCU02576基因的 菌株；以脉孢菌