专利名称：一株纤维素降解菌株lcb12的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种纤维素降解微生物的应用。
背景技术：
纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物，是一类可再生的重要资源和能源。纤维素不 溶于水，在环境中结构稳定、难降解，并广泛存在于农作物秸秆、城市固体废物、畜禽养 殖废弃物和造纸废水中，是难降解污染物之一。目前，从环境中分离和选育纤维素酶高产 菌株，挖掘纤维素酶产生菌的资源，利用微生物的酶解作用，解决环境污染问题，甚至转化 为能源已成为国内外研究热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一株纤维素降解菌株LCB12的应用，能去除畜禽养殖废水中的 纤维素。
本发明所提供的纤维素降解菌株LCB12，为嗜麦芽寡养单胞菌(泣e"o/n^;wwo"做 附a/to;^!7!'a) LCB12 CCTCC N: M 209098，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏 中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCC N: M 20恥98。
一株纤维素降解菌株LCB12的应用，其特征在于所述菌株的应用为嗜麦芽寡养单胞菌 (5tem^o/ /w附卵w wa/to/ fe7/fl) LCB12 CCTCC N: M 209098应用于含纤维素废水(含有纤 维素的废水，纤维素的浓度为300-500mg/L)的处理中。.
所述的嗜麦芽寡养单胞菌(没e"ofroi^owKwa《ma//op/w7/tf) LCB12 CCTCC N: M 209098 应用于含纤维素废水的处理方法为挑取嗜麦芽寡养单胞菌(&朋/rc^ow朋^ma/to/^7to) LCB12 CCTCC N: M 209098单菌落，于LB固体培养基中培养过夜，按培养后的嗜麦芽寡养 单胞菌(及柳o/w/^WM讽氾wa/fop/M'/to) LCB12 CCTCC N: M 209098:含纤维素废水(如畜禽 养殖废水)的体积比为0.5-2- 100，取嗜麦芽寡养单胞菌(Ste"o/ro; /wmwjas w"topfo7Za) LCB12 CCTCC N: M 209098接种于含纤维素废水(如畜禽养殖废水)中，30-35。C恒温培养， pH值为6-8，反应48-72小时。
所述的LB固体培养基为蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g,蒸馏水 lOOOmL,琼脂15g (固)，pH为7.0。
所述的畜禽主要有猪、牛、羊、驴、兔、鸡、鸭、鹅等。
本发明的有益效果是从畜禽养殖场排污口的池底污泥中筛选到一株在纤维素条件下具 有一定生长能力的新菌株。 一株纤维素降解菌株LCBi2有良好的去除畜禽养殖废水中纤维 素的能力，该菌株能使纤维素的去除效率提高8-12%;能在72小时之内去除畜禽养殖废水 中的纤维素24-30fflg/L。
图1是纤维素降解菌株LCB12的PCR产物琼脂糖电泳图(1:核DNA， 2;扩增产物，3: Marker)。
图2是纤维素降解菌株LCB12的扫描电镜图。 图3是纤维素降解菌株LCB12的纤维素酶活数据图。
具体实施例方式
一、 一株纤维素降解菌株LCB12的筛选方法
(一)、材料准备1 、实验废水和池底污泥取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口 。
2、 培养基
筛选土咅养基(g/L): Na2HP043.0， NH4N030.8， MgS04 7H20 0. 1， CaCl20. 1， CMC-Na 2. 0， 微晶纤维素粉l.O，滤纸2.0，稻草2.0， pH值7.0 7.2。
产酶培养基(g/L): Na2HP043. 0， NH4N030. 8， MgS04 7H20 0. 5， CaCl20. 5， FeS04 7H20 0.01， MnSO,' H20 0.01， Z载O.Ol， CMC-Na 10. 0 (或微晶纤维素粉5. 0或纤维二糖5. 0)， 蛋白胨1.0,酵母提取物0.5， pH值7.0 7.2。
LB液体培养基(g/L)为蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸馏水 1000mL， pH7.0。
LB固体培养基(g/L)为蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸馏水 1000raL，琼脂15g (固)，pH7. 0。
LB斜面培养基(g/L)为蛋白胨lO.Og,酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂20g (固)，pH7. 0。
3、 实验仪器和设备 国华SHA--B恒温振荡器， SHH150G光照生物培养箱，
卧式压力蒸汽灭菌器------上海医用核子仪器厂，
光学显微镜-----Olympus有限公司，
pH计等——Hana有限公司，
超净工作台，
鼓风干燥箱，
KYKY-1000B扫描电子显微镜， PTC200型PCR仪， 电泳仪及电泳槽， UVP凝胶紫外观测仪，
微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂厂，DNA提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自 芙国Promega公司、r呵酶、dNTP、 DNAMaxker、 酶均购自日本Takara公司。
(二)、菌株的筛选分离与纯化
1) 、初筛①称取1克畜禽养殖场排污口的池底污泥样品(样品为池底污泥，池底污
泥取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口 )，用20 mL无菌水水洗，8000 rpm离心5 min， 弃上清，再加20mL水，重悬土样；重悬后再加20mL水离心(8000 rpm离心5 min)，弃 上清，重悬上样，此步骤重复操作3次，得到泥水混合物，备用；
② 将泥水混合物转入装有lOOmL筛选培养基的500 mL锥形瓶中，3(TC恒温静至培养 至培养基浑浊，得到菌悬液A;
③ 取5 mL菌悬液A于装100 mL新鲜的筛选培养基的500 mL锥形瓶中培养一周；将 培养一周后的菌悬液取5 mL于装100 mL新鲜的筛选培养基的500 mL锥形瓶中培养一周， 重复操作5-6次，最后得到的菌悬液B;
④ 将最后得到的菌悬液B中取20 A于LB平板上涂布；置3CTC下恒温培养1-3天，挑 取长势良好、菌落形态各不相同的菌落，经2-5次纯化后(纯化用无菌的接种环取培养物
aR平板上的菌落)少许在平板上进行划线；当接种环在LB固体培养基表面上往后移动时， 接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成 一个菌落，即得到纯化后的单菌落}，得到待鉴定的菌落，保种备用。
2) 、 二次筛选将待鉴定的菌落在LB液体培养基中隔夜培养后，点种到筛选培养基平
板上，3(TC恒温培养2~4 d，往培养皿中加入30mL的1 mg/mL的刚果红溶液，染色1 h，
4弃去染液，加入50mL的1 mol/L的NaCl溶液,洗涤1 h，若菌落的周围会出现清晰的透明圈， 说明细菌产生纤维素酶，依据透明圏的直径大小选择直径大的产酶菌株。
用接种针挑取直径大的产酶菌株(在菌落特征上有明显差异的单菌)，对挑取的产酶菌 株在LB平板上进行划线培养，直至获得单一菌株，并于LB斜面培养基上划线保种，得到 一株菌株LCB12，即纤维素降解菌株LCB12。
二、纤维素降解菌株LCB12的鉴定
1、对纤维素降解菌株LCB12的鉴定
对纤维素降解菌株LCB12进行了生理生化的鉴定以及16S rRNA分子的鉴定，从分子水
平确定纤维素降解菌株的种属。
16S rRNA序列分析主要按照以下步骤
1) 提取细菌核DNA，
a) 集菌用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于LB液体培养基管内培养18小时，取其菌 悬液lmL于1. 5mL的离心管中8000rpm离心5min，弃上清液。
b) 加STE缓冲液lmL洗一次，振荡重悬细菌，8000rpm离心5min,弃上清液。
c) 加600 TE缓冲液，剧烈振荡重悬细菌，加入10%的SDS 65|aL， 65。C水浴5-10min。
d) 加等体积酚氯仿抽提三次。
e) 小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3丽aAc， 12000 rpm离心10min。 彻底弃上清。
f) DNA沉淀用70°/。乙醇洗一次，风干后溶于2(VL TE缓冲液备用。
TE缓冲液:lO誦ol /L Tris-Cl (pH8.0); 1,1 /L EDTA-Na2 (pH8. 0)， STE缓冲液0. lmol/L NaCl 丄0,ol/L Tris-Cl (pH8.0) lmmol/L EDTA (pH8. 0)，
2) 16S rRNA基因的PCR扩增，
PCR扩增引物参照Weisburg等人的方法合成。 Pl:正向引物5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3' P2:反向引物5' GGTTACCTTGTTACGACTT3， 在50|aL反应体积中，加入…L模板DNA (0. l吗),0. 5j^L Pl和P2 (终浓度为0. 5|_iM)， l^LdNTP (每种NTPO. 2 mM)， 0. 5pLTaq聚合酶(2 U)禾口 5 IOXPCR缓冲液。PCR扩增 条件为94。C预变性5min;在94。C变性30s， 61-65。C退火30s， 72。C延伸lmin，循环30 次；最后72 °C终延伸10 min。
3) PCR产物的回收
将PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放 入1. 5mL离心管中加2倍体积TE， 65'C水浴10分钟后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取 上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍体积的10mol/L乙酸铵和2倍 体积无水乙醇沉淀，离心，用浓度为70%乙醇洗沉淀一次，风千后溶于适量灭菌双蒸水。
4) 16S rDNA的全序列测定和分析
PCR测序用正反向引物参照Hiraishi等人方法合成。 P-f: CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC; P-r: GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC 。 加入1HL模板DNA (<0. lpg)， PCR扩增30个循环(94 °C 1 min， 55 °C 30s， 72 。C 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒屮染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem 373 A DNA测序仪上测序。测得的16S r丽A序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析， 最终从分子水平上确定该菌的种属。 2、 16S rRNA序列测定本发明采用对16SrRNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的 核DNA为模板，以16S rRNA基丙的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度 为1445bp的扩增带(用1%琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定 其全序列。序列如下-<110> 中国地质大学(武汉)
<120> —株纤维素降解菌株LCB12的应用
<160> 1445
<210> 1
<211> 1445bp
<212> 腿
<213> 嗜麦芽寡养单胞菌(5!te"ofropAo腳"as鹏Z/o/7础")
<400> 1
CAGAGTGAACGCTGGCGGTAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGGAGAGCT60
TGCTCTCTGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCATCGGAATTTACTCTTTCGTG120
GGGGATAACGTAGGGAMCTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCCGGGG180
ACCTTCGGGCCTGGCGCGAATGAATGAGCCGATGCCCGATAGCTAGTTGGCGGGGTAAGA240
GCCCACCAAGGCGACGATCGGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGA300
GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTGGACAATGGGCGCAAGC360
CTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGG420
GAAAGAAAAGCAGTCGGTTAATACCCGATTGTTCTGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCG■
GCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACT540
GGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTGTTTAAGTCTGTCGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCT600
GGGAATTGCGATGGAAACTGGGCGACTAGAGTGTGGCAGAGGATAGTGGAATTCCTGGTG660
TAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGACTGTCTGGGCC720
AACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC780
CACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTA840
ACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGAC900
GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC960
CTGGCCTTGACATGCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACCGTGACA1020
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACG1080
AGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCG1140
GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGC1200
TACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGTCAATCG1260
CAGAAACCCCATCTCAGTCCGTATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCG1320
CTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC1380
CCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGCAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC1440
TGCAC1445
三、菌落形态特征以及生理生化特性-
菌株LCB12的菌落形态菌落呈橘红色、不透明、圆形、表面光滑，中心凸出、边缘 整齐；生理特征细菌呈规则的直杆状，单个或成对排列，常呈V形排列，革兰氏阴性，运动，兼性厌氧，不产生氧化酶和接触酶。最适生长pH值6.5 7.5，最适生长温度25-35 °C，不能在6(TC生长。同时对菌表观也做了扫描电镜观察，结果见图2。 四、菌株LCB12为新的菌株
采用BLAST分析法对菌株LCB12的16S rRNA基因序列与GenBank数据库比较分析发现， 菌株LCB12与嗜麦芽寡养单胞菌(5fe"o加; /20卿"as,toi7MZa)的同源性高迭99. 0%。
综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株LCB12命名为嗜麦芽寡养单胞菌 (Sfe"o的; /wmw7必7wa/to/7/^") LCB12。査阅有关资料，尚嗜麦芽寡养单胞菌属有关畜禽养 殖废水中降解纤维素能力研究的报道。嗜麦芽寡养单胞菌(没e朋/rop/w附o"似wfl/to/^迅a) LCB12为新的菌株，已于2009年5月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)， 保藏号CCTCC N: M 209098。
本发明从自湖北省鄂州市郊某种猪养殖场排污口的池底污泥(沉积底泥)筛选分离出 这一株细菌，并发现其有较好降解纤维素养殖废水的功能。这拓宽了人们对嗜麦芽寡养单 胞菌(5te"o加p/w附朋必附fl/to; M/")在其功能方面的应用研究思路，并为降觯含纤维素畜 禽养殖废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。 五、菌株LCB12的应用
(一)、挑取嗜麦芽寡养单胞菌(5fe"orrop/w附o"as ma/rop/n7/a) LCB12单菌落，于LB 固体培养基中培养过夜，按培养后的嗜麦芽寡养单胞菌(Ste"Wro/^owo"^ ma/to/7/n7/") LCB12:含纤维素废水(如畜禽养殖废水，即实验废水，取自湖北省鄂州市市，某种猪养殖 场排污口)的体积比为0.5-2: 100接种，30-35。C恒温培养，pH值为6-8，反应48-72小时。
所述的LB固体培养基为蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaC110.0g，蒸馏水 1000mL，琼脂15g (固)，pH7.0。
(二)、菌株LCB12产纤维素酶的能力
纤维素是大分子的聚集，由结晶区和无定形区交错而成。将天然纤维素分解，必须依 靠内切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纤维二糖酶(BG)三种酶协同作用 才能完成。为了考察菌株对纤维素的降解能力，研究了在产酶培养基中，细菌生产三种酶 的能力。取产酶培养基100mL加入250mL的锥形瓶中，加入菌株LCB12的菌悬液(配制 用接种环挑取LCB12菌落于10mL LB液体培养基中，3(TC震摇培养12小时)lmL，加入含 纤维素废水(实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养殖场排污口) 100mL (纤维素的浓 度为300-500mg/L)， 3CTC、震摇培养一周，检测各种酶活(见图3)。结果表明，该菌株LCB12 在一周内产生的内切型葡聚糖酶(EG)、外切性葡聚糖酶(CBG)和纤维二糖酶(BG)三 种酶酶活可分别达到13. 9， 6. 2， 15. 2 U/mL。
为了考察该菌株(菌株LCB12)在实际处理畜禽养殖废水的中降解纤维素的能力，研究 了该菌株投加到畜禽养殖废水厌氧反应器中(实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某种猪养 殖场排污口)，纤维素的降解效率。在长期(稳定运行三个月以上)稳定运行的反应器中加 入菌株LCB12的菌悬液(配制用接种环挑取LCB12菌落于10mL LB液体培养基中，30°C 震摇培养12小时)10m L，反应器中含纤维素废水(实验废水，取自湖北省鄂州市市郊某 种猪养殖场排污口)为1000mL (纤维素的浓度为300-500mg/L)， 3(TC、静止一周，再稳定 运行30天，在反应器稳定运行期间定期检测纤维素的去除效率，与未投加该菌株的对照反 应器对比，结果表明，该菌株能在72小时之内去除畜禽养殖废水中的纤维素24-30mg/L; 该菌株能使该反应器处理纤维素的去除效率提高8-12% (原始处理率为65-70%，加入菌株 LCB12后处理率为75-80%)。
权利要求
1.一株纤维素降解菌株LCB12的应用，其特征在于所述菌株的应用为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12 CCTCC NM 209098应用于含纤维素废水的处理中。
2. 根据权利要求1所述的一株纤维素降解菌株LCB12的应用，其特征在于所述的嗜 麦芽寡养单胞菌(5fe"Wrap/w附omw wa/top/ 7/a) LCB12 CCTCC N:M 209098应用于含纤维素 废水的处理方法为挑取嗜麦芽寡养单胞菌(5fe"ofro; / cw7o"ay wa/to户M/") LCB12单菌落， 于LB固体培养基中培养过夜，按培养后的嗜麦芽寡养单胞菌(5fe"Wra/^o腳Mtw m"/topM/a) LCB12:含纤维素废水的体积比为0.5-2: 100，取嗜麦芽寡养单胞菌(5fe"Wrop/w附o"必 wa/topM/fl) LCB12接种于含纤维素废水中，30-35。C恒温培养，pH值为6-8，反应48-72 小时。
3. 根据权利要求2所述的一株纤维素降解菌株LCB12的应用，其特征在于所述的LB 固体培养基为蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g， NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，琼脂 15g， pH为7.0。
全文摘要
本发明涉及一种纤维素降解微生物的应用。一株纤维素降解菌株LCB12的应用，其特征在于所述菌株的应用为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12 CCTCC M209098应用于含纤维素废水的处理中。具体处理方法为挑取嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12单菌落，于LB固体培养基中培养过夜，按培养后的嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12∶含纤维素废水的体积比为0.5-2∶100取嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)LCB12接种于含纤维素废水中，30-35℃恒温培养，pH值为6-8，反应48-72小时。本发明有良好的去除畜禽养殖废水中纤维素的能力。
文档编号C02F3/34GK101665284SQ20091006306
公开日2010年3月10日 申请日期2009年7月6日 优先权日2009年7月6日
发明者珩 刘, 琨 刘, 平 李, 王焰新, 王艳红, 蕾 童 申请人:中国地质大学(武汉)