甘露糖苷酶i的表达基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及甘露糖巧酶I的表达基因的应用，特别设及甘露糖巧酶I(Mnslp)的表 达基因在纤维素酶诱导表达中的应用，属生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 能源环境问题是人类未来生存所必须要面对的挑战，更是制约我国社会可持续发 展的主要因素。W纤维素、半纤维素、木质素为主要组分的植物生物质目前构成了地球上最 大的可再生性资源库。纤维素是由葡萄糖分子通过β-1，4糖巧键连接而成的线性高分子，其 内部结晶区的存在导致其生物降解效率较低。众所周知，纤维素的降解终产物是葡萄糖，葡 萄糖作为一种工业原料可进行多种衍生物的合成。纤维素的降解主要采用化学和生物两种 方法，前者主要是通过强酸或强碱破坏木质纤维素的天然结构，后续处理麻烦且对环境危 害极大;后者主要是通过微生物对木质纤维素进行生物降解，条件溫和且不污染环境，有利 于可持续发展。
[0003] 丝状真菌是有效的纤维素酶生产者，而瑞氏木霉因其具有强大的分泌能力而被用 做研究纤维素酶系统的模式生物。瑞氏木霉的纤维素酶系统主要包括两个纤维素外切酶， 五个已知的纤维素内切酶，屯种β-葡萄糖巧酶还有一些半纤维素酶。在运些纤维素酶的协 同作用下，最终将不溶性的纤维素分解为葡萄糖。但是从生物工程角度进行分析，生物质的 纤维素酶解过程中酶解催化效率较低，酶解所需时间较长，导致在实际应用过程中酶的用 量较大，成本较高，运是阻碍利用纤维素酶解生物质生产燃料乙醇及其它推广应用发展的 关键因素。甘露糖巧酶I(Mnslp)参与整个内质网中所有具有Mari9GlcNAc2多糖结构糖蛋白的 N-糖链修饰过程，产物是MansGlcNAs，当八甘露糖结构的N-糖基存在于错误折叠的蛋白时， 可W作为哺乳动物细胞和酿酒酵母中错误折叠蛋白降解的起始信号。因此，若能进一步增 加糖蛋白正确折叠的效率，就可W相应增加纤维素酶的分泌量和催化降解纤维素的活性。
[0004] 因此，如何进一步提升瑞氏木霉纤维素的分泌量和催化效率，对于促进纤维素酶 工业生产，实现木质纤维素类物质合理利用，解决日益临近的能源与环境危机问题，实现可 持续发展具有极其重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供敲除甘露糖巧酶I(mnslp)基因在提升瑞氏木霉 诱导发酵时的纤维素酶产量及酶催化活性中的应用。
[0006] 甘露糖巧酶I的表达基因在纤维素酶诱导表达中的应用。
[0007] 根据本发明优选的，所述应用，步骤如下：
[000引敲除瑞氏木霉中的甘露糖巧酶I的表达基因，然后经诱导发酵，制得纤维素酶。
[0009] 根据本发明进一步优选的，所述的瑞氏木霉购自美国典型微生物菌种保藏中屯、， 菌种保藏号为:ATCC MYA-256。
[0010] 根据本发明进一步优选的，所述甘露糖巧酶I的表达基因核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，甘露糖巧酶I的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011]甘露糖巧酶 I (ACCESSI0N:XP_006962495)的表达基因位于 scaffold_3:1228177- 1230470ο
[0012] 根据本发明进一步优选的，所述的纤维素酶为外切纤维素酶CBHl、外切纤维素酶 CBH2、内切纤维素酶EG1、内切纤维素酶EG2、内切纤维素酶EG3、内切纤维素酶E(M和/或内切 纤维素酶EG5。
[0013] 根据本发明进一步优选的，所述敲除瑞氏木霉中的甘露糖巧酶I的表达基因，步骤 如下：
[0014] (1) W瑞氏木霉TU6的基因组为模板，W特异引物mnslp叫F和mnslp叫R进行 PCR扩增，制得上游同源臂；
[0015] 特异引物核巧酸序列如下：
[0016] mnslp up F：TAGGGATAACAGGGTAATGGATTGACATGACACGCCCTTAGAA
[0017] mnslp up R：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGTCGGTTATGCTGTAATGCGTGATT； [001引 PCR反应条件如下：
[0019] 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环； 72°C 延伸 lOmin;
[0020] PCR反应体系如下： 5 X PrimcSTAR ΒυΠοΓ ( Mg'" plus ) 10 μΙ dNTP Mixture (冷2.5 niM) 4 μL 叩 F ( 10 μΜ ) Ι.μL,
[0021 ] 叩 R ( 10 μλ'Ο .1.冉 模板 DNA 200 ng PfinicSTAR " HS DNA Polymerase (2.5 U/μΙ) 0,5μ1 灭菌蒸馈水 补足50 μ1.;
[0022] PCR扩增制得上游同源臂为mnslp基因 ORF上游的1.93化片段；
[0023] (2) W瑞氏木霉的基因组为模板，W特异引物皿sip down F和皿sip down R进行 PCR扩增，制得下游同源臂；
[0024] 特异引物核巧酸序列如下：
[00巧]皿S1P down F:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATGAGTTGGATGAAAACGAAGAGGT
[0026] 皿sip down R:ATTACCCTGTTATCCCTATCAGGTGAAGCCTATCGTGGTGAAA;
[0027] PCR反应条件如下：
[002引 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环； 72°C 延伸 lOmin;
[0029] PCR反应体系如下： 5 X PrimcSTAR " Buffer ( Mg-' plus) 10 μ1 dNTP Mixture ( f^2.5 mM) 4 μ1 inns Ip down F ( 10 μΜ ') ?μL.
[0030] nwsip down R ( 10 μΜ ) 1μ1 模板DNA 200 ng PrimeSTA民', HS DNA Pofym知a泼（玄5 ?/μ1) 0.5μ1 灭菌蒸溜水 拂足50 μ1 ;
[0031] PCR扩增制得下游同源臂为mnslp基因 ORF下游的1.67化片段；
[0032] (3)将步骤（1)制得的上游同源臂与步骤(2)制得的下游同源臂采用BP colne反应 试剂盒（Gateway及Technology with Clonase?lI)参照Invitrogen使用说明书通过化 clone反应)连入具有pyrG筛选标记的pD0NR?221载体中（购自Invihogen公司），筛选具有 上下游同源臂的质粒，制得含有Δ皿sip: :pyrG敲除盒的质粒；
[0033] (4)将步骤(3)制得的含有Δ皿slp::pyrG敲除盒的质粒用I-Scel酶切线性化后， 凝胶回收，W尿巧营养缺陷型瑞氏木霉TU6为出发菌株进行原生质体转化，挑取在无尿巧的 MM平板上可W生长的转化子，即得。
[0034] 最优的，所述步骤(4)中瑞氏木霉TU6购自美国典型微生物菌种保藏中屯、，菌种保 藏号为:ATCC MYA-256。
[0035] 无尿巧的MM平板，每升组分如下：
[0036] 葡萄糖 20g、（NH4)2S045g、K2HP04l5g，化0H调pH至5.5。
[0037] 根据本发明进一步优选的，所述的诱导发酵，条件如下：
[0038] 在瑞氏木霉预培养培养基中接种瑞氏木霉的抱子106个，30°C，200转/分钟培养36 小时，用G1砂忍漏斗收集菌丝并转移到新鲜的瑞氏木霉预培养培养基中继续培养12小时， 最后将菌丝收集并W24g/L的接种量转接至诱导培养基中，3(TC，200转/分钟继续培养，每 隔12小时取发酵液，进行纤维素酶表达的检测。
[0039] 所述预培养培养基，每升组分如下：
[0040] (NH4)2S〇a.4g、K2HP〇42.0g、化抽P〇4 · 12出0 17.907g、Urea(尿素）0.3g、Tween 80 (吐溫80 )0.5ml、MgS〇4〇 . 6g、CaC!2〇 . 6g、FeS〇4 · 7H20 5 . Omg、MnS〇4 · H2O 1.6mg、 ZnS04l.4mg、CoCl22.0mg、尿巧2.44g、甘油10ml、蛋白腺lg，巧樣酸调pH至5.0。
[0041 ]所述诱导培养基，每升组分如下：
[0042] (NH4)2S〇a.4g、K2HP〇42.0g、化抽P〇4 · 12出0 17.907g、Urea(尿素）0.3g、Tween 80 (吐溫80 )0.5ml、MgS〇4〇 . 6g、CaC!2〇 . 6g、FeS〇4 · 7H2O 5 . Omg、MnS〇4 · H2O 1.6mg、 alS04l.4mg、CoCl22.0mg、尿巧2.44g、微晶纤维素10g，巧樣酸调pH至5.0。
[0043] 有益效果
[0044] 本发明提供了一种提升纤维素酶产量的方法，从原料和后期分离纯化工艺两方面 降低了纤维素酶的生产成本，构建的微生物在同等条件下能提升纤维素酶的产量及催化降 解纤维素的活性，对于促进纤维素酶工业生产，实现木质纤维素类物质合理利用，解决日益 临近的能源与环境危机问题，实现可持续发展具有极其重大的意义，因此具有广阔的应用 前景，同时对于进一步掲示纤维素酶蛋白折叠及基因的诱导表达调控机制具有促进作用。
【附图说明】
[0045] 图1是本发明采用的具有pyrG筛选抗性的pDONR质粒图；
[0046] 图2是Δ皿sip: :pyrG敲除质粒构建过程电泳图；
[0047] 其中：泳道1，上游同源臂PCR产物电泳验证;泳道2,下游同源臂PCR产物电泳验证； 泳道3, Δ皿sip: :pyrG质粒包含上游同源臂的PCR和电泳验证;泳道4, Δ皿sip: :pyrG质粒 包含下游同源臂的PCR和电泳验证；泳道5，Δ皿sip: :pyrG质粒被I-Scel线性化后电泳验 证；
[004引图3是瑞氏木霉Amnslp转化子的PCR筛选验证图；
[0049]