其中：左图代表内部PCR错定和电泳验证，右图代表上游PCR错定和电泳验证;泳道 1代表出发菌株TU6;泳道2-8代表待筛选的转化子；
[(K)加]图4是瑞氏木霉Amnslp转化子的Southern blot筛选验证图；
[0化1] 图5是皿sip的敲除对CB化分泌的影响Western Blot检测结果图；
[0052] 其中：黑色条带为纤维素酶CBH1;横坐标代表不同的取样时间；相对强度值为CBH1 信号相对强度值，代表CB化分泌量；
[0053] 图6皿sip的敲除对瑞氏木霉菌株胞外蛋白量的影响；
[0054] 图7 mnslp敲除菌株发酵上清降解Avicel产生还原糖能力的变化图；
[0055] 图8 mnslp敲除菌株发酵上清降解Avicel能力的变化图；
[0056] 图9皿sip敲除菌株发酵上清降解pNPC能力的变化图；
[0057] 图10 mnslp敲除菌株发酵上清降解CMC能力的变化图。
【具体实施方式】
[0058] 下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人 员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。根据附图 和方法的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显 然。
[0059] 除非特别指出，否则本发明中所使用的分子生物学实验方法，基本上参照 J . Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989 ; W及 F. Μ. Ausube 1等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wi ley&Sons，Inc.，1995中所述 的方法进行或者按照产品说明书进行。
[0060] 所用试剂未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。本领域技术人 员知晓，实施例W举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
[0061 ]实施例中的瑞氏木霉购自美国典型微生物困种保臧中屯、，困种保臧号为：ATCC MYA-256。
[0062] 瑞氏木霉TU6购自美国典型微生物菌种保藏中屯、，菌种保藏号为:ATCC MYA-256。
[0063] 实施例中所述Δ皿S1P为甘露糖巧酶I基因敲除的瑞氏木霉TU6。
[0064] 实施例中瑞氏木霉预培养培养基，每升组分如下： (NH4):S04 1.4 g K：HP04 2.0 g Na:HP〇4.12H:0， 17.907 g Urea (尿素） 0.3 g Tvv.cc円 80 (口; 1.溫'80) 0.5 ml MgS〇4 0.6 g CaCl· 0.6 g
[00 化] - FcS〇4*7H:0 5.0 mg MiiS〇4*H:0 1.6 mg ZnS〇4 1.4 mg C0CI2 2.0 nig Ur谢取'（尿巧） 2.44 g Glycerol (甘油） 10 ml pijptone (蛋白陈》 Ig
[0066] Citric Acid(巧樣酸)调抑至5.0。
[0067] 实施例中所述诱导培养基，每升组分如下： (NH4):，'S04 1.4 g K2HPO4 2.0 g Na：HP〇4-12H2〇 17.907 g Urea (冰糸> 0.3 g Tween 80 (Ι!|.??ιιι.8〇) 0.5 ml MgS〇4 0.6 g
[006引 CaCl· 0.6 g FoS04*7H20 5.0 mg MnS04*H20 1.6 mg ZnS04 1.4 mg C0CI2 2.0 mg Uridine (尿巧） 2.44 g Avicc! 101
[0069] Citric Acid(巧樣酸)调抑至5.0。
[0070] 实施例中用到的引物如表1所示：
[0071] 表1 Δ皿sip菌株构建过程中用到的引物及序列
[0072]
[0073]
[0074] 实施例1
[0075] 敲除瑞氏木霉中的甘露糖巧酶I的表达基因，步骤如下：
[0076] (1似瑞氏木霉的基因组为模板，W特异引物皿sip up F和皿sip up R进行PCR扩 增，利用OMEGA的切cle Pure Kit试剂盒进行纯化(方法参照试剂盒说明书），制得上游同源 臂；
[0077] 特异引物核巧酸序列如下：
[0078] mnslp up F：TAGGGATAACAGGGTAATGGATTGACATGACACGCCCTTAGAA
[00巧]mnslp up R:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAAGTCGGTTATGCTGTAATGCGTGATT; [0080] PCR反应条件如下：
[0081 ] 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环； 72°C 延伸 lOmin;
[0082] PCR反应体系如下： 5 X PrimcSTAR BulTcr ( Mg'" plus) 10 μ! dNTP Mix山rc (种2.5 mM) 4 μ1 "叩 F (10 μ.Μ ) I μ1
[0083] nwsIp up R (ΙΟμΜ) lul 模板DNA [ 200 ng Prinx'STA艮'' HS DNA 化lymcr化c (2.5 U/μΙ) ().5μ! 灭菌蒸溜水 补足50 μ1
[0084] PCR扩增制得上游同源臂为皿sip基因 ORF上游的1.93化片段，经检测，上游同源臂 浓度为21化g/μ 1。
[00化](2) W瑞氏木霉的基因组为模板，W特异引物皿sip down F和皿sip down R进行 PCR扩增，利用OMEGA的切cle化re Kit试剂盒进行纯化(方法参照试剂盒说明书），制得下 游同源臂；
[0086] 特异引物核巧酸序列如下：
[0087] 皿S1P down F:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAATGAGTTGGATGAAAACGAAGAGGT
[0088]皿sip down R:ATTACCCTGTTATCCCTATCAGGTGAAGCCTATCGTGGTGAAA;
[00例 PCR反应条件如下：
[0090] 95°C预变性10min;95°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸1~2min，反应30个循环； 72°C 延伸 lOmin;
[0091] PCR反应体系如下： 5 X PHmeSTAR " BulTcr ( Mg]- p!us) 10 μΙ dNTP Mix山re (林 15 mM) 4 μ1 mnslp down F ( 10 μΜ ) ΙμΙ
[0092] mnslp down R (10 μΜ) 1μ1 模板DNA □ 200 ng PrimcSTA民"HS DNA Polymerase (2.5 ?/μL) 0.5μ1 灭菌蒸溜水 补足50
[0093] PCR扩增制得下游同源臂为皿sip基因 ORF下游的1.67化片段，经检测，下游同源臂 浓度为20化g/μL。
[0094] (3)将步骤（1)制得的上游同源臂与步骤(2)制得的下游同源臂采用BP colne反应 试剂盒（Galeway某Technology with Clonase?lI)参照invitrogen使用说明书通过化 clone反应)连入具有pyrG筛选标记的pD0NR?221载体(购自Invihogen公司）中，如图1所 示，在Km抗性平板上挑取可生长的转化子至液体培养基中培养1她，利用OMEGA质粒提取试 剂盒提取质粒(方法参照试剂盒说明书），经1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒的滞后，挑选滞后 的质粒进行PC閲金证，可扩增出上下游同源臂的质粒即为构建成功的含有Δ皿sip: :pyrG敲 除盒的质粒(如图2所示），制得含有Amnslp :: pyrG敲除盒的质粒；
[00M] (4)将步骤(3)制得的含有Δ皿slp::pyrG敲除盒的质粒用I-Scel酶切线性化后进 行凝胶回收，W尿巧营养缺陷型菌株TU6为出发菌株进行原生质体转化，挑取在无尿巧的MM 平板上可W生长的转化子。W皿sip up AnF/Vdonr-R为引物对转化子进行上游错定，同时 W皿sip 0RF AnF/皿sip 0RF AnR为引物对转化子进行内部基因敲除验证，结果如图3所 示，转化子2、4、5、7、8已经无法扩增出皿sip内部基因，且成功获得3.化b的上游错定条带， 运说明皿sip基因被成功敲除。当WEcoR V对转化子2的基因组进行酶切，W皿sip的上游同 源臂做为探针进行Southern blot验证时（图4)，得到敲除菌株Δ皿sip 7.8化和出发菌株 TU62.78化的预期条带。再次证明，皿sip基因在瑞氏木霉TU6中已经成功敲除。
[0096] 无尿巧的MM平板，每升组分如下：
[0097] 葡萄糖 20g、（NH4)2S045g、K2HP04l5g，化0H调pH至5.5。
[009引实施例2
[0099] Amnslp菌株外切纤维素酶1(CB化）及蛋白分泌能力的确定
[0100] 2.1在瑞氏木霉预培养培养基中接种瑞氏木霉的抱子106个，3(TC，200转/分钟培 养36小时，用G1砂忍漏斗收集菌丝并转移到新鲜的瑞氏木霉预培养培养基中继续培养12小 时，最后将菌丝收集并W24g/L的接种量转接至诱导培养基中，继续在3(TC，200转/分钟条 件下培养，每隔12小时取发酵液，进行纤维素酶表达的检测。
[0101] 2.2对步骤2.1中获得的发酵液利用纤维素酶CBH1的多克隆抗体通过Western Blot进行检测。
[0102] 1)将样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶的浓度为8wt% (方法参照《蛋白质操作手 册》），然后进行电转法将蛋白转印到PVD刊莫上，转印条件为电压100V，转印时间为地。
[0103] 2)转膜后，用含有0.1 wt%吐溫20(Tween-20)的PBS缓冲液润洗膜。
[0104] 3)用封闭液浸泡膜，封闭液为含有3wt%牛血清白蛋白（BSA)和O.lwt%吐溫20 (Tween-20)的PBS缓冲液，常溫下轻轻振荡化。