一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工催化剂活化领域，特别设及一种用于非水相环境催化的憐醋 酶印迹激活方法。
【背景技术】
[0002] 憐脂酶(Phospholipase,EC 3.1.1.4;EC 3.1.1.3;EC 3.1.4.4;EC 3.1.1.5)是一 大类具有重要价值的水解酶，具有催化憐脂类化合物的合成、水解、转醋、醋交换等多种反 应的能力，是化工生产，医药合成及食品加工中最重要的酶之一。常见憐脂酶主要包括憐脂 酶A1，憐脂酶A2,憐脂酶C，憐脂酶D等几类。例如憐脂酶A1和憐脂酶A2,能在油水界面上催化 憐脂及甘油Ξ醋α位和β位的醋水解、醇解、醋合成、醋交换等反应，在食品、化工，特别是油 脂精炼等多个领域被广泛应用。憐脂酶C催化甘油与憐酸基团之间憐酸醋键等合成与断裂， 主要用于油脂精炼行业。憐脂酶D催化憐脂中憐酸基团与碱基之间等水解、合成、转醋等，在 医药化工行业中具有重要地位。
[0003] 对绝大部分常规酶来说，催化反应是在水溶液环境中进行的，有机溶剂能明显降 低酶的催化能力，甚至使酶失活，但不少具有重要价值的产品的合成和一些重要的反应需 要在非水相环境中尤其是有机溶剂中进行，如毛油及混合油的酶法精炼。因此，提高酶在非 水相催化过程中的性能就成为了研究的热点。非水相酶催化概念由Zaks和Κ1化anov在1984 年提出，他们发现某些脂肪酶在有机溶剂环境下仍具有一定的催化活力，并W此为基础合 成了一系列有机化合物。经过几十年的发展，非水相酶催化技术得到一定的发展，溶剂系统 不再局限在单一有机溶剂，所使用酶的种类也得到了进一步拓展。相较于非生物催化化工 及水相生物催化，非水相酶催化具有一定优势，主要表现在增加底物有效浓度;反应平衡向 合成方向移动;微生物污染少;酶热稳定性提高;酶重复使用性提高;下游过程能耗降低;减 少副反应;提高酶特异性和选择性等方面。然而，非水相中酶活性不高始终是制约该技术发 展进入工业应用的最大因素。随着相关研究的不断推进，深入探讨酶在有机相中活力降低 的原因，发现运些原因是可W解决的，通过合理的、系统的策略设计，及酶激活改性，可多数 量级的提高酶在有机相中的活力，并最终达到酶在水相中的活力水平。
[0004] 憐脂是毛油中的主要杂质之一，W溶质状态均匀分散在毛油或混合油中。憐脂在 高溫条件下，容易发生化学反应生成深色色素及异味化合物，更高溫度下脱水焦化，严重影 响食用油品质。憐脂含量较高的食用油在后期储藏过程中，极易氧化酸败，品质劣变。因此， 去除毛油中的憐脂是油脂精炼过程中重要的一环，该过程也叫毛油脱胶。工业上常用的水 化脱胶，利用憐脂分子的两亲性质，往毛油中加入一定量的水，卵憐脂等亲水性较强的憐脂 吸水膨胀，聚团形成胶状沉淀从毛油中分离出来。但非水化憐脂，特别是憐脂酸巧儀盐，不 能W运种形式从毛油中分离。酶法脱胶可W利用憐脂酶的催化活力，将非水化憐脂转化为 亲水性更强的溶血憐脂进而水化分离，或者切除憐酸基团，将其转化为二酷甘油，W达到脱 除憐脂的目的。由于毛油脱胶体系与常规水相反应体系差异较大，特别是在混合油体系中， 正己烧或轻质溶剂油对酶活力有强烈抑制作用，很多憐脂酶不能像在水溶液中一样表现较 高的活力，提高憐醋酶在非水相条件下的活力意义重大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提出一种适用于非水相环境催化的憐醋酶印迹激活方法。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：一种用于非水相环境催化的憐醋酶印迹激活 方法，包括W下步骤：
[0007] (1)憐脂酶印迹激活:将憐脂酶溶解于含印迹因子的缓冲液中进行激活，印迹因子 为憐脂或其衍生物；
[0008] (2)印迹憐脂酶固定化:加入娃藻±，充分震荡混匀、静置，完成固定化吸附；
[0009] (3)冻干:将完成固定化及抗冻保护的印迹憐脂酶进行预冻，再进行真空冷冻干燥 呈粉末，即为固定化印迹憐脂酶粉；
[0010] (4)洗涂：固定化印迹憐脂酶粉中加入洗涂液，充分满旋振荡分散，静置后滤去溶 剂，重复洗涂，洗去印迹因子；
[0011] (5)脱溶:将洗涂好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品酶粉。
[001^ 优选地，步骤(1)中缓冲液浓度为10~500mM0l/L，激活条件为4~4(TC、2~30min。 [OOU]优选地，步骤(1)中所述的印迹因子与缓冲液的体积比化：10~250。
[0014]优选地，步骤(1)中所述的缓冲液为巧樣酸或憐酸或Tris-HCl;所述憐脂酶为憐脂 酶A1、憐脂酶A2、憐脂酶C、憐脂酶D中的一种;所述憐脂或其衍生物为憐脂酸、憐脂巧盐、憐 脂儀盐的一种。其中巧樣酸及憐酸是现有油脂精炼工业中最常用的酸化剂，Tris-HCl是生 化反应常用抑缓冲系统，酸-盐缓冲范围与本发明设及酶最适抑范围相符，且不会干扰成品 酶剂的使用。
[001引优选地，步骤(2)中静置的溫度为4~40°C、时间为2~30min。
[0016] 优选地，步骤(2)中的娃藻±是按照上一步骤体系体积的10~100%(w/v)加入。
[0017] 优选地，步骤(3)中预冻的溫度为-20~-80°C，真空冷冻干燥的条件为溫度为-60 ~-80°C、真空度1~500Pa。当溫度高于-20°C时，含印迹因子、酶蛋白及缓冲盐的印迹体系 难W充分冻结，在真空干燥过程中会造成大量气泡鼓出，成品得率降低等不良后果。
[0018] 优选地，步骤(4)中，按照固定化印迹憐脂酶粉2~10倍体积加入洗涂液，满旋振荡 分散的溫度为4~40°C，静置时间为2~30min，重复洗涂次数为3~4次。本发明使用的印迹 激活剂在油脂精炼过程中为难脱除杂质，该激活剂易溶解于非极性有机溶剂，考虑到后续 脱溶条件及有机溶剂对酶蛋白的变性影响，优选洗涂液为正己烧、石油酸，乙酸中的一种。 洗涂条件低于该提出范围，印迹因子残留对后续使用的不良影响不能被忽略。
[0019] 优选地，在步骤(1)、（2)之间还进行抗冻保护，在激活的印迹憐脂酶中加入抗冻保 护剂，混合均匀、静置后，完成抗冻保护。
[0020] 优选地，所述的抗冻保护剂为甘油或甘露糖;抗冻保护剂浓度为0~500mMol/L，静 置的溫度为4~40°C、时间为2~30min。甘油及甘露糖是生化常用抗冻保护剂，且具有无毒， 水溶，对后续步骤及成品使用无不良影响的特点。在该范围内，抗冻保护剂能有效保护酶活 性不在预冻及冷冻真空干燥环节中降低，更高浓度的抗冻保护剂条件下，洗涂印迹因子环 节难度加大，且成品酶剂不易保持粉末性状，影响后续保存使用。
[0021] 本发明的优点是：
[0022] 本发明利用憐脂酶蛋白分子构象在水相中的柔性，采用冷冻干燥的方法将憐脂酶 蛋白构象进行诱导固化，使之保持适合与底物结合的状态，利于催化反应进行。由于在非水 介质中憐脂酶蛋白构象相对刚性，该方法所提供的憐脂酶高催化活性构象更容易得到保 持。在生物印迹过程的基础上，通过将印迹憐脂酶分子与固定化载体结合，可W提高憐脂酶 在有机溶剂中的分散性，进一步提高憐脂酶催化能力，同时为憐脂酶的重复使用提供回收 基础。
[0023] 另外，本发明工艺简单，激活效果明显，生产成本低，具有广阔的工业应用前景和 经济价值。经印迹激活固定化后，憐脂酶在非水相介质中活力可提高1~2个数量级，底物特 异性也有明显增强，在工业生产，特别是油脂精炼加工中有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1
[00巧]量取50g憐脂酶AULecitase叫tra，12000IU/g)，溶解于300mL含5%憐脂酸巧盐 的pH 4.5，浓度为2〇1111〇1几的巧樣酸缓冲液乳液中，20°(：条件下，静置1〇111111。加入8邑 (148mMol/L)甘露糖，充分溶解混匀后，20°C条件下，静置lOmin。加入150g(50%，w/v)娃藻 上，充分满旋振荡，混合均匀，20°C静置lOmin。混合物于-20°C下预冻至完全冻结，经-80°C， 1化低溫冻干成为固定化印迹憐脂酶A1。加入900mL正己烧，充分振荡混匀，20°C下静置 lOmin，过滤除去溶剂，重复Ξ次。将洗去印迹因子的固定化印迹憐脂酶真空干燥除去有机 溶剂，4°C下密封保存。经测定，在含水4%的正己烧环境下，W憐脂酸巧为底物催化水解反 应，印迹激活憐脂酶A1活力比未激活憐脂酶提高79倍，使用油酸甘油Ξ醋作为竞争性底物 测定，酶底物特异性提高213倍。