一种醛酮还原酶突变体、基因、工程菌及其应用
【专利说明】-种酵酬还原酶突变体、基因、工程菌及其应用 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种阿托伐他汀双手性中间体的制备方法，特别设及一种乳酸克鲁维 酵母醒酬还原酶突变体和编码基因、载体、重组工程菌，W及该醒酬还原酶在不对称还原6- 氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋制备阿托伐他汀双手性中间体6-氯基-(3R，5R)-二径 基己酸叔下醋中的应用。 (二)【背景技术】
[0002] 6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋，是阿托伐他汀合成工艺路线中的重要手性 中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部口对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值 >99.5%，d.e.值>99%) ,6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋的合成技术成为阿托伐他汀 合成的关键核屯、技术。传统的6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋化学合成工艺从酬酸 (醋）出发，通过不对称合成构建手性中屯、，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的棚烧、正下 基裡等及深冷等特殊环境，导致产物d. e.值低、得率低、能耗大。而且，反应产生的棚化物废 物处理困难，需要经过繁琐的反复甲醇泽灭、真空蒸馈处理。酶具有优异的选择性、反应条 件溫和，一般在常溫、常压及近中性条件下进行，把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副 反应降到最低限度，生物催化技术具备提高过程原子经济性、实现过程绿色环境友好的基 本条件。因此，开发生物不对称还原6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋合成6-氯基- (3R，5R)-二径基己酸叔下醋技术，具有巨大的经济效益和社会效益。
[0003] 醒酬还原酶超家族是一类NAD(P化依赖型氧化还原酶，广泛分布于动物、植物和微 生物细胞内，参与细胞内代谢反应，消除环境中有害物质对细胞的不良影响。目前已发现的 醒酬还原酶已超过190种，分布于16个家族。醒酬还原酶通常为约320个氨基酸组成单亚基 蛋白，大小为34-3化Da,具有(α/β)8筒状结构，其催化四联体由酪氨酸(Tyr)、组氨酸化is)、 天冬氨酸(Asp)和赖氨酸化ys)构成，底物作用谱宽，包括脂肪族和芳香组醒和酬、单糖、类 固醇及前列腺素等。目前已有许多醒酬还原酶基因被克隆并在外源宿主中表达广泛用于不 对称合成手性中间体，其中一些被用于不对称还原合成阿托伐他汀中间体6-氯基-(3R, 5R)-二径基己酸叔下醋。
[0004] 我们已经从乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到 的醒酬还原酶K1AKR，并在大肠杆菌化scherichia coli)实现异源过量表达化nzyme and Microbial Technology 2015，77:68-77)。该酶能够催化6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔 下醋不对称还原合成6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋，产物de值大于99%。但该酶对6- 氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋的活力并不高，从而限制了其工业化应用。通过已报道 的醒酬还原酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的 氨基酸位点，通过定点突变技术提高醒酬还原酶对6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋 的催化活力，将具有较强的工业应用价值。 (Ξ)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是针对之前报道的醒酬还原酶KIAKR对6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己 酸叔下醋不对称还原活性较低的问题，提供一种醒酬还原酶突变体蛋白质及其编码基因， 含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，将表达该醒酬还原酶突变体的重组工程菌破碎 之后的粗酶液作为催化剂催化6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋的不对称还原反应， 制备光学纯6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋。与野生型醒酬还原酶相比，本发明提供的 醒酬还原酶突变体具有更高的催化活性。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种醒酬还原酶突变体，所述醒酬还原酶突变体是将SEQ ID NO. 1所 示氨基酸序列的第295位、第296位进行单突变或双突变获得的，优选所述醒酬还原酶突变 体是将SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位进行单突变或对第295位和第296位进行双 突变获得的。
[000引进一步，优选所述单突变是将SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变 为色氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，核巧酸序列为SEQ ID NO.5所示;所述双突变为 将SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变为色氨酸，并将第296位色氨酸突变 为亮氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO 3所示，核巧酸序列为SEQ ID NO.6所示。
[0009] 本发明使用定点饱和突变技术对醒酬还原酶K1AKR编码基因进行突变，连接表达 载体后转化宿主大肠杆菌，诱导表达后再通过高效液相检测方法将活性提高的正突变检 出。获得的突变体能催化（1~50g/L)6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋不对称还原，审U 备光学纯6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋，具体方法如下：来源于K.lactis CCTCC Μ 2014380克隆得到的醒酬还原酶KlAKR(GenBank accession number :KU145407)由309个氨 基酸残基组成，已成功构建表达载体pET28b-klakr，功能正常的酶蛋白在大肠杆菌化21 (DE3)中实现过量表达。然后经过同源建模和分子对接，根据最优构象选择潜在的可能影响 酶活性的位点。设定定点饱和突变位点，再设计并合成适当的引物，W所述的含亲本醒酬还 原酶基因的重组表达质粒为模板，PCR扩增全长突变基因的质粒。通过将含有全长突变的质 粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高活性的阳性突变子。最后从阳 性突变子中抽提出质粒DNA，进行DNA测序分析，W确定引物的突变。在本发明醒酬还原酶突 变体的制备中，可W采用任何合适的载体。
[0010] 本发明还提供一种所述醒酬还原酶突变体编码基因，所述醒酬还原酶突变体编码 基因构建的重组载体及重组基因工程菌，优选所述重组质粒是祀T28b;所述宿主细胞是大 肠杆菌E.coli BL2UDE3)。
[0011] 本发明还设及醒酬还原酶突变体编码基因在制备重组醒酬还原酶中的应用，所述 应用为:构建含所述醒酬还原酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优 选大肠杆菌）中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组醒酬还原 酶的菌体细胞，与野生型醒酬还原酶相比，具有更高的催化活性。
[0012] 本发明还设及一种所述醒酬还原酶突变体在制备6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔 下醋中的应用，具体所述的应用W含醒酬还原酶突变体基因的重组基因工程菌经发酵培养 获得的湿菌体为催化剂，W6-氯基-(5R)-径基-3-幾基己酸叔下醋为底物，W含葡萄糖脱氨 酶基因的工程菌发酵培养获得的葡萄糖脱氨酶湿菌体为辅酶再生酶，W葡萄糖为辅助底 物，W抑7.0、lOOmM憐酸盐缓冲液为反应介质，将催化剂和葡萄糖脱氨酶湿菌体用反应介 质悬浮，超声破碎，再加入底物和辅助底物，在30°C，200r/min条件下反应，反应完全后，获 得6-氯基-(3R，5R)-二径基己酸叔下醋;所述葡萄糖脱氨酶W含葡萄糖脱氨酶基因的工程 菌化scherichia Co 1 i BL21 (DE3)/pET28b-esg化)发酵培养获得湿菌体，具体所述重组基 sibiricum的葡萄糖脱氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b构建重组表达质 粒，并将该重组质粒导入大肠杆菌制得的;所述葡萄糖脱氨酶湿菌体用量为10-250g/L缓冲 液(优选25g/L)，所述催化剂的用量W湿菌体重量计为10-250g/L缓冲液(优选75g/L)，所述 底物终浓度为1-lOOg/L缓冲液(优选50g/L)，所述葡萄糖的终浓度为5-300g/L缓冲液(优选 200g/L)。
[0013]进一步，所述催化剂按如下方法制备:将含醒酬还原酶突变体基因的重组工程菌 接种至含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C培养lOh，再W体积浓度4 %接种 到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养至菌体浓度0D6日日为0.6- 0.8，再向培养液中加入终浓度为9g/L的乳糖，28 °C培养1化后，4 °C、8000g离屯、lOmin，收集 菌体细胞。所述含葡萄糖脱氨酶基因的工程菌发酵培养获得的湿菌体制备方法同含醒酬还 原酶突变体基因的重组工程菌。进一步，所述超声破碎条件为:冰浴置于超声破碎仪中，W 400W功率破碎20min，破Is停Is。
[0014]本发明所述葡萄糖脱氨酶湿菌体制备方法为：将来源于Exiguobacterium sibiricum的葡萄糖脱氨酶基因 （GenBank No .KM817194.1)插入祀T-28b构建重组表达质 粒，并将该重组质粒导入大肠杆菌Escherichia Coli BL2UDE3)获得含葡萄糖脱氨酶基因 的重组基因工程菌;将含葡萄糖脱氨酶基因的重组工程菌接种至含终浓度50mg/L卡那霉素 的LB液体培养基中，37 °C培养lOh，再W体积浓度4 %接种到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉 素的LB液体培养基中，37°C培养至菌体浓度OD600为0.6-0.8,再向培养液中加入终浓度为 9g/L的乳糖，28 °C培养1化后，4°C、8000g离屯、1 Omin，收集菌体细胞。
[0015] 本发明所述的醒酬还原酶突变体可工程菌全细胞形式使用，也可