α－半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：α－半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种编码糖苷酶的基因及其编码的蛋白，尤其涉及一种从青霉(Penicillium sp.)中分离、克隆的编码α-半乳糖苷酶的基因；本发明还涉及含有本发明基因的重组表达载体和含有本发明基因的宿主细胞以及它们的制备方法，此外，本发明还涉及重组α-半乳糖苷酶的制备以及该α-半乳糖苷酶的用途。
背景技术：
α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC3.2.1.22)即蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能够专一生催化糖链非还原末端α-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含α-半乳糖苷键的寡糖，而且还能够催化含该键的多糖。棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖是豆类植物中广泛存在的低聚寡糖，在α-半乳糖苷酶的作用下，这些寡糖可以被分解为D-半乳糖和其他相应的单糖和寡糖。
α-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。在微生物中，细菌、放线菌、丝状真菌、酵母等都能合成α-半乳糖苷酶。目前，已分离筛选出许多产α-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物α-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的α-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用(den Herder I.F.，et al.Mol.Gen.Genet.233，404-410)。因此产α-半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。
在制糖工业中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜黏度增加而阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜，使糖产量降低。应用α-半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(Ganter C.，et al.Journal of Biotechnology.8(4)301-310)。同时酶法制糖可使蔗糖的粒状结晶的均匀性、色泽和纯度得到改善。
在大豆及其制品中，含有1％的棉子糖、4％的水苏糖和微量的毛蕊花糖。这些寡糖阻碍人类对豆类的消化吸收，能够产生胀气等疾病，而人胃肠道不分泌α-半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入α-半乳糖苷酶，可以分解这些寡糖，增加人类对豆类营养的吸收(Prashanth S J and Mulimani V H.，Process Biochemistry.401199-1205)。
纠尔豆胶是一种食品，含有38-40％的α-半乳糖，半乳糖是以残基形式连接于甘露糖为主链的甘露聚糖上。半乳糖侧链的存在对半乳甘露聚糖的特性影响很大。α-D-半乳糖基侧链的多少及位置，决定其在水中的溶解度和胶凝能力。纠尔豆胶与刺槐胶相比，其胶凝能力较弱，如用α-半乳糖苷酶来进行改性处理，适量除去侧链的半乳糖残基而不使甘露聚糖主链断裂，可提高水溶性，也极大提高纠尔豆胶的胶凝能力，提高其商品性(Luonteri E.，et al.Enzyme Microb.Technol.22(3)，192-198)。
豆粕是非常优秀的植物性蛋白质饲料原料，一般在日粮中的用量为25～30％。但在豆粕中含有5～6％的单胃动物不能消化的α-半乳糖苷类的低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，这些寡糖一方面会引起动物的肠胃胀气疾病，另一方面会增加食糜的粘度，从而降低了动物对营养物质的消化与吸收。而在豆科饲料中添加α-半乳糖苷酶能够增加饲料中低聚寡糖的消化，减少此类低聚寡糖的抗营养作用，减轻或消除单胃动物的消化紊乱，从而提高饲料中营养物质的利用率和代谢能(Ghazi S.，et al.British Poultry Science.44(3)410-418)。现有的α-半乳糖苷酶对于大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖的分解能力尚差强人意，所以提供一种新的能够有效分解大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖的α-半乳糖苷酶具有重要的意义。

发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的α-半乳糖苷酶Agl1，该α-半乳糖苷酶能够有效分解大豆中的α-半乳糖苷类的低聚寡糖，例如棉子糖、水苏糖等。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种α-半乳糖苷酶Agl1，其含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物。
优选的，本发明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；更优选的，本发明α-半乳糖苷酶具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述α-半乳糖苷酶的基因。
本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种编码α-半乳糖苷酶的基因，该基因具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；或(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)编码具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。
优选的，本发明编码α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；本发明编码α-半乳糖苷酶的基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本发明所要解决的第三个技术问题是构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达质粒及获取含有该重组表达载体的重组菌株。
本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术途径来实现的本发明的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将将SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ IDNO1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO1所示的核苷酸序列插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-Agl1。
本发明所构建的重组酵母表达质粒可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞可为毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母细胞(Saccharomycescerevisiae)或乳酸酵母细胞(Hansenula polymorpha)。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/Agl1。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种制备所述的α-半乳糖苷酶的方法。
本发明所要解决的又一个技术问题是通过以下技术途径来实现的优选的，一种制备本发明α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤构建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。
上述制备α-半乳糖苷酶的方法中，优选的，所述的重组表达质粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重组菌株为GS115/Agl1。
本文中，所述的“多个”通常意味着2～60个，优选为2～15个，这些取决于α-半乳糖苷酶的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基；所述的“严谨条件”是指杂交液为5～6×SSC，42～75℃杂交过夜，室温至37℃用2×SSC洗涤一至两次，优选的，所述的“严谨条件”为杂交液为6×SSC，68℃杂交过夜，37℃用2×SSC洗涤两次。
本发明整体技术方案的详细描述1、α-半乳糖苷酶的分离纯化和测序本发明首先通过超滤、FPLC等技术从青霉(Penicillium sp.)F63分离纯化青霉电泳纯的α-半乳糖苷酶；将所分离的电泳纯的α-半乳糖苷酶利用ESI-MS/MS质谱仪进行测序。
2、α-半乳糖苷酶基因的克隆提取青霉F63基因组DNA，根据内肽序列设计简并引物扩增α-半乳糖苷酶的部分核苷酸序列，再通过反向PCR克隆到编码α-半乳糖苷酶基因全长。
3、α-半乳糖苷酶cDNA序列的获得提取青霉菌丝体RNA，采用RT-PCR的方式扩增得到α-半乳糖苷酶的cDNA序列。
4、重组α-半乳糖苷酶的酶的制备将α-半乳糖苷酶基因连入真核表达载体pPIC9，获得重组质粒。利用电击法转入毕赤酵母GS115。诱导毕赤酵母宿主菌表达外源基因，制备重组α-半乳糖苷酶。
5、重组α-半乳糖苷酶酶学性质鉴定通过酶活测定检测重组α-半乳糖苷酶的基本酶学性质。


图1纯化的α-半乳糖苷酶Agl1的SDS-PAGE分析(A)和Native-PAGE分析(B)(5-14％梯度)。
(A)SDS-PAGE.1分子量标准；2纯化的酶。
(B)Native gradient PAGE。1分子量标准；2纯化的α-半乳糖苷酶(注箭头所指的位置为纯化的α-半乳糖苷酶)。
图2嵌套反向PCR扩增产物电泳分析。
1.分子量标准；2-4.PCR产物。
图3α-半乳糖苷酶cDNA扩增产物电泳分析。
1.分子量标准；2.NEGATIVE CK；3 Agl1 CDNA。
图4 Agl1在毕赤酵母中表达的α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析。
1.分子量标准蛋白重量；2.GS115和质粒pPIC9；3.甲醇诱导前的发酵上清；4-9所表达的重组α-半乳糖苷酶在不同诱导时间的发酵上清。
图5重组α-半乳糖苷酶Agl-R的SDS-PAGE分析。
1.分子量标准；2.发酵培养上清；3.通过HiTrap Q Sepharose的重组α-半乳糖苷酶；4.纯化的重组α-半乳糖苷酶。
图6本发明重组α-半乳糖苷酶的最适pH值。
图7本发明重组α-半乳糖苷酶pH稳定性。
图8本发明重组α-半乳糖苷酶反应温度。
图9本发明重组α-半乳糖苷酶热稳定性。
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施例方式
试验材料和试剂1、菌株及载体Penicillium F63(CGMCC No.1669；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期2006年4月5日；北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所)，毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。PNPGal、蜜二糖、棉子糖、水苏糖及瓜尔豆均购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基(1)青霉培养基为马铃薯汁培养基1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂。
(2)诱导产酶培养基(0.4％K2HPO4，0.28％(wt/vol)(NH4)2SO4，0.12％(wt/vol)CaCl2，0.12％(wt/vol)尿素，0.12％(wt/vol)MgSO4，0.02％(wt/vol)甘露糖，0.02％(wt/vol)酵母提取物和3％(wt/vol)豆粕)(3)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。
说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1青霉菌α-半乳糖苷酶的分离纯化青霉(Penicillium)F63被接种在产酶培养基中诱导表达α-半乳糖苷酶。诱导7天后离心菌体获得培养基上清，将培养基上清用20-95％的(NH4)2SO4沉淀，沉淀物重悬在20mM、pH8.0的Tris-HCl中，透析过夜。
透析后的样品用超滤管浓缩。2mL的样品上预先用20mM、pH8.0的Tris-HCl平衡的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱(Amersham Pharmacia Biotech)。用NaCl盐梯度洗脱结合在柱子上的蛋白，在0.3M的盐梯度下，含有α-半乳糖苷酶组分的蛋白被洗脱下来。
500uL浓缩的含α-半乳糖苷酶组分的样品上Sephacryl S-200 HR分子筛(Amersham Pharmacia Biotech)，分子筛用含0.3M NaCl的20mM、pH8.0的Tris-HCl溶液洗脱，收集仅含α-半乳糖苷酶的组分。
对纯化过程中的离子交换层析，凝胶层析各步分别进行了酶活性测定及蛋白浓度测定，结果见表1。纯化完成后，比活性从粗酶液的9.6U/mg提高到纯酶的106.4U/mg，纯化倍数为11倍，得率10.1％。SDS-PAGE结果表明，纯化后的α-半乳糖苷酶蛋白仅有一条单一的条带，分子量约为82kD(图1)。
表1 α-半乳糖苷酶Agl1纯化结果

注蛋白浓度用考马斯亮兰G250法测定。
实施例2α-半乳糖苷酶蛋白的测序。
将实施例1中分子筛纯化后的α-半乳糖苷酶浓缩，SDS-PAGE电泳，电泳纯的α-半乳糖苷酶单一条带进行胶内酶切。用质谱仪对肽段进行测序，获得6段内肽，这6段内肽的氨基酸序列分别为LFVLDDGWFK、QSEGYTVSEFQYK、VNPLVLTGDMWR、DNAGLGDWLPNP、LEGLDENALYK和PEVQDFLLK。经序列比对后，发现其中有4段内肽与已知的α-半乳糖苷酶有较高的同源性，另外两端内肽没有找到与之同源的α-半乳糖苷酶序列。其中LFVLDDGWFK与黑曲霉、构巢曲霉、木霉、犁头霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为100％、88％、100％和88％；QSEGYTVSEFQYK与黑曲霉、构巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为66％、66％和76％；VNPLVLTGDMWR与黑曲霉、构巢曲霉、木霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为58％、75％和75％；DNAGLGDWLPNP与黑曲霉、构巢曲霉、木霉、犁头霉α-半乳糖苷酶的相应肽段的同源性为91％、84％、83％和76％。没有找到与另外两段内肽LEGLDENALYK和PEVQDFLLK同源的α-半乳糖苷酶序列。说明实施例1中从青霉(Penicillium)F63中分离、纯化的α-半乳糖苷酶是一种新的α-半乳糖苷酶。
实施例3青霉菌α-半乳糖苷酶编码基因Agl1的克隆提取青霉菌(Penicillium sp)F63基因组DNA取30℃培养7天后的青霉F63菌液60000rpm离心10min。取100mg菌丝体加500μL无菌水清洗，离心取沉淀。
沉淀重悬于500μL提取液混合液，于37℃温育60min，10000rpm离心10min去沉淀。上清液用等体积酚、酚∶氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。12000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30μL无菌水溶解，备用。
根据测序的α-半乳糖苷酶的内肽序列设计合成简并引物P1，P2(P15’-(T/C)T(A/G/C/T)GA(T/C)GA(T/C)GGCTGGTTT-3’；P25’-C(G/T)CCACAT(A/G)TC(A/G/C/T)CC(A/G/C/T)GT-3’)。以青霉菌F63总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94℃变性3min后冷却至4℃；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环后72℃保温10min。得到一约800bp片段，将该片段回收后测序。
根据测序得到的核甘酸序列设计反向PCR引物P3，P4(P35’-GCCGGGGCTCATTGCTCTCGC-3’；P45’-CGTCTGGGAACCGCTCAGGG-3’)。用限制性内切酶SalI酶切青霉F63基因组DNA，然后用T4DNA连接酶使酶切片段自身环化，以此自身环化的DNA片段作为PCR反应的模板进行反向PCR扩增。通过反向PCR得到一个长3200bp的基因片段(图2)。扩增得到产物回收后测序。
实施例4α-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析提取青霉菌菌丝体的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计引物(Prgal1，5’-AAAGGTATGTATTTCCCGG-3’；Prgal2，5’-CTATTGCTTTTCCAACATCA-3’)扩增该单链cDNA，获得α-半乳糖苷酶的cDNA序列(图3)，扩增得到产物回收后测序。
通过比较α-半乳糖苷酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因没有内含子，GTG为其翻译起始密码子。该基因为2205bp，编码一个含有714个氨基酸的成熟α-半乳糖苷酶，以及一个含有21个氨基酸的信号肽。其中，SEQ ID NO1所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶的cDNA序列；SEQ ID NO2所示的氨基酸序列为本发明成熟α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO3所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶的DNA序列；SEQ ID NO4所示的核苷酸序列为编码本发明α-半乳糖苷酶信号肽的核苷酸序列；SEQ ID NO5所示的氨基酸序列为本发明α-半乳糖苷酶的氨基酸序列；SEQ ID NO6所示的氨基酸序列为本发明α-半乳糖苷酶信号肽的氨基酸序列。所测出的基因Agl1的成熟蛋白部分核甘酸序列与GeneBank上的α-半乳糖苷酶基因序列进行同源比较，最高同源性为69％，氨基酸序列最高同源性也为69.5％，证明从青霉菌(Penicillium sp)F63中分离克隆得到的编码α-半乳糖苷酶的基因为新基因。
实施例5重组α-半乳糖苷酶的制备。
将表达载体pPIC9进行双酶切(SnaBI+NotI)，同时将编码α-半乳糖苷酶的基因Agl1(SEQ ID NO1)双酶切(SnaBI+NotI)，切出编码成熟α-半乳糖苷酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有青霉菌α-半乳糖苷酶基因Agl1的重组质粒pPIC-Agl1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/Agl1。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于200mL YPD培养液中，30℃250rpm振然过夜培养，然后接种于发酵基本培养基于3L发酵罐中发酵。经过基础培养、碳源饲喂和诱导培养三个阶段共156h，重组α-半乳糖苷酶的表达量达到111U/mL。SDS-PAGE结果(图4)表明，重组α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的α-半乳糖苷酶经过HiTrap Q Sepharose FPLC之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的90％以上(图5)，说明本纯化方法是高效的。
实施例6重组α-半乳糖苷酶的活性分析。
比色法将PNPGal溶于0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，使其终浓度为20mM。将10uL酶液，90uL的去离子水和100uL20mM的PNPGal混合，摇匀。37℃温育5min后，反应液中加入2.8mL1M的Na2CO3溶液来终止反应。在405nm处测其OD值，并计算酶活。酶活(U/mL)单位定义在pH4.5、37℃下每分钟分解PNPGal释放1μmol p-硝基酚所需的酶量被定义为一个酶活单位。
实施例7重组α-半乳糖苷酶Agl1的最适pH及pH稳定性测定将实施例5纯化的重组α-半乳糖苷酶Agl1在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0～7.5的乙酸-磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～9.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的重组α-半乳糖苷酶Agl1在不同pH的缓冲体系，37℃下测定的pH适性结果表明(图6)重组α-半乳糖苷酶Agl1的最适pH为5.0，在pH4.2～7.0范围内，酶活性维持在75％以上，而在pH3.0以下，基本检测不到酶活性。
将酶液在不同pH值的缓冲液中于常温下处理12h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明，本发明重组α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5之间保持最适pH下酶活的75％以上(图7)，说明本发明重组α-半乳糖苷酶在pH5.0～6.5有较好的稳定性。
实施例8重组α-半乳糖苷酶Agl1酶反应最适温度及热稳定性最适温度的测定在乙酸-磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果表明，重组α-半乳糖苷酶Agl1最适温度为45℃。在37℃～48℃范围内，酶活性维持在75％以上(图8)。
酶的热稳定性试验表明，在40℃下保温60min，剩余酶活性为61.1％。45℃下保温10min，剩余酶活性为8.4％。50℃保温2min，剩余酶活性为15.4％(图9)。试验结果说明，本发明重组α-半乳糖苷酶在40℃以下是稳定的。
实施例9不同化学试剂对α-半乳糖苷酶Agl1酶活性的影响试验在酶促反应体系中加入不同的化学试剂(终浓度为1mmol/L)，研究不同化学试剂对酶活性的影响。结果表明，只有Hg2+完全抑制本发明α-半乳糖苷酶活性，SDS、Cu2+对本发明α-半乳糖苷酶Agl1有明显的抑制作用。其余化学试剂对本发明α-半乳糖苷酶Agl1的酶促反应无显著影响(表2)。
表2各种金属离子和化学试剂对α-半乳糖苷酶活性的影响

实施例10本发明α-半乳糖苷酶Agl1的底物特异性试验将蜜二糖、棉子糖和水苏糖用乙酸-磷酸氢二钠(pH5.0)缓冲液溶解，浓度为1.0mg/mL。而瓜儿豆胶的浓度为3.0mg/mL。在酶反应最适温度和最适pH值下，用离子色谱CARBOPAC PA10测定实施例5所纯化的重组α-半乳糖苷酶对不同底物的作用。结果表明，本发明重组α-半乳糖苷酶Agl1对瓜儿豆胶没有活性。酶对底物的降解次序为蜜二糖(80.7％)＞棉子糖(67.5％)＞水苏糖(64.8％)(表3)。
表3α-半乳糖苷酶Agl1对不同底物的作用

试验结果表明，本发明α-半乳糖苷酶能够有效的将蜜二糖、棉子糖或水苏糖酶解为D-半乳糖。
序列表<110>中国农业科学院饲料研究所<120>α-半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和应用<130>p0897<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2142<212>DNA<213>Penicillium sp.
<220>
<221>CDS<222>(1)..(2142)<400>1gcg gat aat act ctc ttt gct ctc aat gga gaa aat gtt tcg tac cgc 48Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu Asn Val Ser Tyr Arg1 5 10 15atc cat gtg gac aac acc act ggt gat ctc cta gga gac cat ttc ggc 96Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu Gly Asp His Phe Gly20 25 30ggc tcc gtc gga gct aat atc cct ctg gag act gta ggc gag gtc aat144Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr Val Gly Glu Val Asn35 40 45ggc tgg agt agt cat ata gga cgt gtg cgc cgc gag ttc cca gac caa192Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln50 55 60ggc cga ggg gat ttc cgg acc cct gcg att cgc att cgt cag tca gaa240Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Ser Glu65 70 75 80ggg tat acc gta tct gaa ttc cag tac aaa tcg cac aag atc atc gcc288Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser His Lys Ile Ile Ala85 90 95ggc aag ccc gct ctg cct ggg ttg cca gcc acg aca ggc aca gaa gag336Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Thr Gly Thr Glu Glu100 105 110gat gtt agc act ttg atc atc agt ctg tat gac aag tac agc gat gtg384Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp Lys Tyr Ser Asp Val115 120 125gct gca gac ctc tcc tac tca att ttc cct aag cac gat gcc att gtg432Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys His Asp Ala Ile Val130 135 140cgc agc gtg aat gtt acg aat cac gga gag gca aac atc aca atc gag480Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala Asn Ile Thr Ile Glu145 150 155 160tct ctg gcc agt ctg agc gtg gat ttg ccg ttt gag gaa ctg gac atg528Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe Glu Glu Leu Asp Met165 170 175atc agt ctt cgt gga gac tgg gcg agg gaa gcg cac cgc gag agg aaa576Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala His Arg Glu Arg Lys180 185 190agg gtc acg tac ggt acc caa ggc ttt gga agt tcc aat ggg tac tcc624Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser Ser Asn Gly Tyr Ser195 200 205
序列表tct cac ctc cac aat cct ttc ctg gcg ttg gca gat ccc tct gcc acc672Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala Asp Pro Ser Ala Thr210 215 220gag tcc caa gga gag gta tgg gga ttc tcg ctt gtg tac aca ggt tca720Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser225 230 235 240ttc tcc gtg gag gtc gag aag ggt tca cag ggt ttc acg cgt gcc ctt768Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr Arg Ala Leu245 250 255ctg ggt ttc aac cct ggt cag ctt tcg tgg act ttg ccg cca ggt gag816Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr Leu Pro Pro Gly Glu260 265 270act ctt act tcc ccg gaa tgt gtc tcg gta tac tcc cgg gat ggc atc864Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr Ser Arg Asp Gly Ile275 280 285ggc gga atg tca cgc tcg ctg cat cgc ttg tac cgc aac cat ctc atc912Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile290 295 300aag agc aag ttt gct acc agt gat cgt cct acg ttg ctg aac aat tgg960Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr Leu Leu Asn Ser Trp305 310 315 320gaa gga ctg tat ttc gat tac aac cag agc agt atc tac gag ctg gca 1008Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Tyr Glu Leu Ala325 330 335aag gga gcc gcc gaa gta ggc gct aag ctc ttc gtt ctg gat gac ggc 1056Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly340 345 350tgg ttc ggc aag gaa tac cca cgt ctc tct gac aat gcc ggg ctg ggc 1104Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly355 360 365gac tgg atc cca aac cct gag cgg ttc cca gac ggc ctg gag ccg ctt 1152Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp Gly Leu Glu Pro Leu370 375 380gtg aaa aag atc acg gac ctc aaa gcc gct aac acg tca aca aac atg 1200Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn Thr Ser Thr Asn Met385 390 395 400cgc ttt ggt atc tgg ttc gag ccg gaa atg gtc aat ccg aac tcg act 1248Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr405 410 415ctg tat aac gag cac ccg gac tgg gcc cta cat gca gga ccc tac cct 1296Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro420 425 430cgc acc gaa aga cgc agc cag ctc gta ttg aac ctc gct ctt cct gaa 1344Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu435 440 445gtc csa gac ttc atc atc aag tcc gtc tca gat att ctc aag agt gca 1392Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp Ile Leu Lys Ser Ala450 455 460gat att agt tac gtc aag tgg gat aac aac agg ggc att cac gag acg 1440Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Ile His Glu Thr465 470 475 480cct tcg cca gcc aca agc cac gcc tac atg ctc ggt ctg tac cgc gtt 1488Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val485 490 495ttc gag gaa ctg aca acc caa ttc ccc gat gtc ctc tgg gag ggt tgc 1536Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys500 505 510
序列表gcg tcg ggt gga ggc cgt ttc gac cca ggt gtt ctc cag tat ttc ccg1584Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro515 520 525cag atc tgg aca tcg gac aac aca gac gca atc gat cgc atc acc atc1632Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp Arg Ile Thr Ile530 535 540cag ctt ggc act tcg ctc gcc tac ccg cct agc gcg atg ggt gct cac1680Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His545 550 555 560ctg tcc caa gtg ccg aac cac cag act ggc cgt aca gtc ccc gtg gct1728Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Val Ala565 570 575gtc cgc gga cat gtc gcg atg atg ggc ggc tcg ttt ggc ttg gaa ctc1776Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu580 585 590gat ccc gct gca atg gac gct gat gac aag gca gct atg ccg ggg ctc1824Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala Ala Met Pro Gly Leu595 600 605att gct ctc gct gag aag gta aat ccc att gtt ctt act ggt gat atg1872Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val Leu Thr Gly Asp Met610 615 620tgg cga ttg aac ctt ccg gag gac tcg aat tgg cct gct gtt ttg ttc1920Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp Pro Ala Val Leu Phe625 630 635 640atc gcc gag gat ggt cag aag gct gtg ttg ttt gtc ttc cag ctc gct1968Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe Val Phe Gln Leu Ala645 650 655cca aat gtc gat cat tca tgg ccc cgc gtt agg ttg gag gga ttg gat2016Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg Leu Glu Gly Leu Asp660 665 670gag aat gct tta tat aag att gat gat ggt gtg gtt tac tct ggt gga2064Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val Val Tyr Ser Gly Gly675 680 685acc ttg atg aat atc ggt ctg caa ttc ccc ttt aag ggt gac tat ggc2112Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe Lys Gly Asp Tyr Gly690 695 700agt caa gtt gtg atg ttg gaa aag caa tag2142Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln705 710<210>2<211>713<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>2Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu Asn Val Ser Tyr Arg1 5 10 15Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu Gly Asp His Phe Gly20 25 30Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr Val Gly Glu Val Asn35 40 45Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg Glu Phe Pro Asp Gln50 55 60
序列表Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg Ile Arg Gln Ser Glu65 70 75 80Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser His Lys Ile Ile Ala85 90 95Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr Thr Gly Thr Glu Glu100 105 110Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp Lys Tyr Ser Asp Val115 120 125Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys His Asp Ala Ile Val130 135 140Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala Asn Ile Thr Ile Glu145 150 155 160Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe Glu Glu Leu Asp Met165 170 175Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala His Arg Glu Arg Lys180 185 190Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser Ser Asn Gly Tyr Ser195 200 205Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala Asp Pro Ser Ala Thr210 215 220Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu Val Tyr Thr Gly Ser225 230 235 240Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly Phe Thr Arg Ala Leu245 250 255Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr Leu Pro Pro Gly Glu260 265 270Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr Ser Arg Asp Gly Ile275 280 285Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile290 295 300Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr Leu Leu Asn Ser Trp305 310 315 320Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser Ile Tyr Glu Leu Ala325 330 335Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe Val Leu Asp Asp Gly340 345 350Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly
序列表355 360 365Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp Gly Leu Glu Pro Leu370 375 380Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn Thr Ser Thr Asn Met385 390 395 400Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asn Ser Thr405 410 415Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His Ala Gly Pro Tyr Pro420 425 430Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu435 440 445Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp Ile Leu Lys Ser Ala450 455 460Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg Gly Ile His Glu Thr465 470 475 480Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu Gly Leu Tyr Arg Val485 490 495Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys500 505 510Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val Leu Gln Tyr Phe Pro515 520 525Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile Asp Arg Ile Thr Ile530 535 540Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His545 550 555 560Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg Thr Val Pro Val Ala565 570 575Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu580 585 590Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala Ala Met Pro Gly Leu595 600 605Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val Leu Thr Gly Asp Met610 615 620Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp Pro Ala Val Leu Phe625 630 635 640Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe Val Phe Gln Leu Ala645 650 655
序列表Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg Leu Glu Gly Leu Asp660 665 670Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val Val Tyr Ser Gly Gly675 680 685Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe Lys Gly Asp Tyr Gly690 695 700Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln705 710<210>3<211>3216<212>DNA<213>Penicillium sp.
<400>3gtcgacgtca ctaacatatg agttcgggat ctgttgggcc ggggtatgac tggcttaccg60acatgtcgca caggcctttg ctggtctcat tattcccaaa gagaaaagga ccacttgtta 120aagcattggc aaattggagg agttaagcag actgtgtcgg gattgaaaga agcaaaagcc 180aatgagcgaa gttcaaaccc gcccgcgaca cggagtatcc ccggagtttc ctccgcattt 240tcgactccac agttataaac cccaacatat gtagtagtat atacttccaa gtatcgccga 300agttggtttt tggatccgca tttcaagagc catagttcag cagactcgta gaagtctgtt 360cttggcaatt gagacccatt tctacgtgat tgagatctac ataggtcgag ccaaccttgg 420aatacctgca tgtaatctcc ccacaagtcg gggaaaagac gtcggggtaa aagatataaa 480aaggtatgta tttcccgggg ttgggatttg aattctatca aaaacacggc aaaaatggtt 540tacttatcaa ggggtgttgc agtggctaca tgcctagggc tacttgcaca ttcctccgct 600attatggcta aggaattaac cactaagcgt gagtcctttg cttctgtctt ttatagtttc 660aaatctaacc atatatccta tagcaatcgc ggcggatggt actctctttg ctctcaatgg 720agaaaatgtt tcgtaccgca tccatgtgga caacaccact ggtgatctcc taggagacca 780tttcggcggc tccgtcggag ctaatatccc tctggagact gtaggcgagg tcaatggctg 840gagtagtcat ataggacgtg tgcgccgcga gttcccagac caaggccgag gggatttccg 900gacccctgcg attcgcattc gtcagtcaga aaggtatacc gtatctgaat tccagtacaa 960atcgcacaag atcatcgccg gcaagcccgc tctgcctggg ttgccagcca cgacaggcac 1020agaagaggat gttagcactt tgatcatcag tctgtatgac aagtacagcg atgtggctgc 1080agacctctcc tactcaattt tccctaagca cgatgccatt gtgcgcagcg tgaatgttac 1140gaatcacgga gaggcaaaca tcacaatcga gtctctggcc agtctgagcg tggatttgcc 1200gtttgaggaa ctggacatga tcagtcttcg tggagactgg gcgagggaag cgcaccgcga 1260gaggaaaagg gtcacgtacg gtacccaagg ctttggaagt tccaatgggt actcctctca 1320cctccacaat cctttcctgg cgttggcaga tccctctgcc accgagtccc aaggagaggt 1380atggggattc tcgcttgtgt acacaggttc attctccgtg gaggtcgaga agggttcaca 1440gggtttcacg cgtgcccttc tgggtttcaa ccctggtcag ctttcgtgga ctttgccgcc 1500aggtgagact cttacttccc cggaatgtgt ctcggtatac tcccgggatg gcatcggcgg 1560aatgtcacgc tcgctgcatc gcttgtaccg caaccatctc atcaagagca agtttgctac 1620
序列表cagtgatcgt cctacgttgc tgaacagttg ggaaggactg tatttcgatt acaaccagag 1680cagtatctac gagctggcaa agggagccgc cgaagtaggc gctaagctct tcgttctgga 1740tgacggctgg ttcggcaagg aatacccacg tctctctgac aatgccgggc tgggcgactg 1800gatcccaaac cctgagcggt tcccagacgg cctggagccg cttgtgaaaa agatcacgga 1860cctcaaagcc gctaacacgt caacaaacat gcgctttggt atctggttcg agccggaaat 1920ggtcaatccg aactcgactc tgtataacga gcacccggac tgggccctac atgcaggacc 1980ctaccctcgc accgaaagac gcagccagct cgtattgaac ctcgctcttc ctgaagtcca 2040agacttcatc atcaagtccg tctcagatat tctcaagagt gcagatatta gttacgtcaa 2100gtgggataac aacaggggca ttcacgagac gccttcgcca gccacaagcc acgcctacat 2160gctcggtctg taccgcgttt tcgaggaact gacaacccaa ttccccgatg tcctctggga 2220gggttgcgcg tcgggtggag gccgtttcga cccaggtgtt ctccagtatt tcccgcagat 2280ctggacatcg gacaacacag acgcaatcga tcgcatcacc atccagcttg gcacttcgct 2340cgcctacccg cctagcgcga tgggtgctca cctgtcccaa gtgccgaacc accagactgg 2400ccgtacagtc cccgtggctg tccgcggaca tgtcgcgatg atgggcggct cgtttggctt 2460ggaactcgat cccgctgcaa tggacgctga tgacaaggca gctatgccgg ggctcattgc 2520tctcgctgag aaggtaaatc ccattgttct tactggtgat atgtggcgat tgaaccttcc 2580ggaggactcg aattggcctg ctgttttgtt catcgccagg gatggtcaga aggctgtgtt 2640gtttgtcttc cagctcgctc caaatgtcga tcattcatgg ccccgcgtta ggttggaggg 2700attggatgag aatgctttat ataagattga tgatggtgtg gtttactctg gtggaacctt 2760gatgaatatc ggtctgcaat tcccctttaa gggtgactat ggcagtcaag ttgtgatgtt 2820ggaaaagcaa tagagaggac ttgcaatatc ggctcaatag ttatatttga gcggcaacgg 2880ttgtgagcag tcatgctatt tcataggatt cgacaagtta agaaccaaat atcaacattc 2940caagattgct gaataatgag ataatatatt tgcaagaggg atatccaatt caagactgtt 3000tgtaaactca tgttggcctt ccaaggttga tgatcttagt attattctgc cggacgaaaa 3060aaacccgctt atcgataagc tcgccttctc taatcccctc cgactctgac tccttccagc 3120ctctaattta ttcttaacga actattcaac atggcagatg cagacgagga cgctattcgc 3180gcccctgaaa atgcctctgc acagcccgag gtcgac3216<210>4<211>63<212>DNA<213>Penicillium sp.
<400>4gtgagtcctt tgcttctgtc ttttatagtt tcaaatctaa ccatatatcc tatagcaatc 60gcg 63<210>5<211>234<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>5Val Ser Pro Leu Leu Leu Ser Phe Ile Val Ser Asn Leu Thr Ile Tyr1 5 10 15
序列表Pro Ile Ala Ile Ala Ala Asp Gly Thr Leu Phe Ala Leu Asn Gly Glu20 25 30Asn Val Ser Tyr Arg Ile His Val Asp Asn Thr Thr Gly Asp Leu Leu35 40 45Gly Asp His Phe Gly Gly Ser Val Gly Ala Asn Ile Pro Leu Glu Thr50 55 60Val Gly Glu Val Asn Gly Trp Ser Ser His Ile Gly Arg Val Arg Arg65 70 75 80Glu Phe Pro Asp Gln Gly Arg Gly Asp Phe Arg Thr Pro Ala Ile Arg85 90 95Ile Arg Gln Ser Glu Gly Tyr Thr Val Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Ser100 105 110His Lys Ile Ile Ala Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ala Thr115 120 125Thr Gly Thr Glu Glu Asp Val Ser Thr Leu Ile Ile Ser Leu Tyr Asp130 135 140Lys Tyr Ser Asp Val Ala Ala Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro Lys145 150 155 160His Asp Ala Ile Val Arg Ser Val Asn Val Thr Asn His Gly Glu Ala165 170 175Asn Ile Thr Ile Glu Ser Leu Ala Ser Leu Ser Val Asp Leu Pro Phe180 185 190Glu Glu Leu Asp Met Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu Ala195 200 205His Arg Glu Arg Lys Arg Val Thr Tyr Gly Thr Gln Gly Phe Gly Ser210 215 220Ser Asn Gly Tyr Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Leu Ala225 230 235 240Asp Pro Ser Ala Thr Glu Ser Gln Gly Glu Val Trp Gly Phe Ser Leu245 250 255Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Glu Val Glu Lys Gly Ser Gln Gly260 265 270Phe Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Gly Gln Leu Ser Trp Thr275 280 285Leu Pro Pro Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val Tyr290 295 300Ser Arg Asp Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Leu His Arg Leu Tyr
序列表305 310 315 320Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro Thr325 330 335Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Gln Ser Ser340 345 350Ile Tyr Glu Leu Ala Lys Gly Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Phe355 360 365Val Leu Asp Asp Gly Trp Phe Gly Lys Glu Tyr Pro Arg Leu Ser Asp370 375 380Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Ile Pro Asn Pro Glu Arg Phe Pro Asp385 390 395 400Gly Leu Glu Pro Leu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Lys Ala Ala Asn405 410 415Thr Ser Thr Asn Met Arg Phe Gly Ile Trp Phe Glu Pro Glu Met Val420 425 430Asn Pro Asn Ser Thr Leu Tyr Asn Glu His Pro Asp Trp Ala Leu His435 440 445Ala Gly Pro Tyr Pro Arg Thr Glu Arg Arg Ser Gln Leu Val Leu Asn450 455 460Leu Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp Phe Ile Ile Lys Ser Val Ser Asp465 470 475 480Ile Leu Lys Ser Ala Asp Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Asn Asn Arg485 490 495Gly Ile His Glu Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser His Ala Tyr Met Leu500 505 510Gly Leu Tyr Arg Val Phe Glu Glu Leu Thr Thr Gln Phe Pro Asp Val515 520 525Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly Val530 535 540Leu Gln Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala Ile545 550 555 560Asp Arg Ile Thr Ile Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro Ser565 570 575Ala Met Gly Ala His Leu Ser Gln Val Pro Asn His Gln Thr Gly Arg580 585 590Thr Val Pro Val Ala Val Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly Ser595 600 605
序列表Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Ala Met Asp Ala Asp Asp Lys Ala610 615 620Ala Met Pro Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile Val625 630 635 640Leu Thr Gly Asp Met Trp Arg Leu Asn Leu Pro Glu Asp Ser Asn Trp645 650 655Pro Ala Val Leu Phe Ile Ala Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Leu Phe660 665 670Val Phe Gln Leu Ala Pro Asn Val Asp His Ser Trp Pro Arg Val Arg675 680 685Leu Glu Gly Leu Asp Glu Asn Ala Leu Tyr Lys Ile Asp Asp Gly Val690 695 700Val Tyr Ser Gly Gly Thr Leu Met Asn Ile Gly Leu Gln Phe Pro Phe705 710 715 720Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Gln Val Val Met Leu Glu Lys Gln725 730<210>6<211>21<212>PRT<213>Penicillium sp.
<400>6Met Ser Pro Leu Leu Leu Ser Phe Ile Val Ser Asn Leu Thr Ile Tyr15 10 15Pro Ile Ala Ile Ala20
权利要求
1.一种α-半乳糖苷酶，其特征在于含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列；或(b)将SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物。
2.根据权利要求1的α-半乳糖苷酶，其特征在于其具有SEQ ID NO2或SEQID NO5所示的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1所述α-半乳糖苷酶的基因，其特征在于具有以下(a)、(b)、(c)或(d)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列；或(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)编码具有α-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQ ID NO2或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。
4.按照权利要求3的基因，其特征在于其具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达质粒。
6.按照权利要求5的重组表达质粒，其特征是所述的重组表达质粒是pPIC9-Agl1。
7.含有权利要求5或6所述重组表达质粒的重组菌株。
8.按照权利要求7的重组菌株，其特征是所述的重组菌株是GS115/Agl1。
9.一种制备权利要求1所述的α-半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤构建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养重组菌株，诱导重组α-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α-半乳糖苷酶。
10.按照权利要求9的方法，其特征是所述的重组表达质粒是pPIC9-Agl1；所述的宿主细胞是毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，所述的重组菌株为GS115/Agl1。
全文摘要
本发明公开了一种新的α－半乳糖苷酶基因、其编码蛋白及其制备方法和用途。本发明首先从青霉(Penicillium sp.)F63(CGMCC No.1669)中分离纯化出α－半乳糖苷酶，再分离、克隆得到编码该酶的基因(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列)。此外，本发明还公开了制备该α－半乳糖苷酶的方法，包括构建含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；培养用该重组表达质粒所转化的宿主细胞，得重组菌株；培养该重组菌株，诱导重组α－半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的α－半乳糖苷酶。通过核苷酸和氨基酸序列比较，该α－半乳糖苷酶为一新的α－半乳糖苷酶。试验证实，本发明α－半乳糖苷酶能够较好的水解大豆中棉子糖和水苏糖，可应用于饲料和食品工业。
文档编号C12N15/63GK101074435SQ20061008045
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月16日 优先权日2006年5月16日
发明者姚斌, 王亚茹, 罗会颖, 密士军, 史秀云, 袁铁铮, 柏映国, 杨培龙, 孟昆 申请人:中国农业科学院饲料研究所