专利名称：α－半乳糖苷酶缺陷的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗α-半乳糖苷酶A缺陷的方法和组合物。
背景技术：
Fabry病(费勃莱氏病，酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏症)是X染色体连锁的遗传性溶酶体贮积病，特征为严重的肾损伤、血管角质瘤、和心血管异常(包括心室膨大和二尖瓣闭锁不全)。Fabry病还影响外周神经系统，引起极度痛苦的发作，四肢灼痛。Fabry病是由α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的缺陷引起的。α-Gal A是溶酶体糖水解酶，切割各种复合糖的末端α-半乳糖基部分。Fabry病导致阻断中性糖神经鞘脂--酰基鞘氨醇己三糖苷(CTH)的分解代谢，并在细胞内和血流中积累这种酶底物。
由于这种疾病具有X染色体连锁的遗传模式，大多数Fabry病患者是男性。虽然已经观察到受到严重影响的女性杂合子，但是女性杂合子通常没有症状，或者具有相对较弱的症状(诸如特征性角膜混浊)。剩余α-Gal A活性低、抑或有很微弱的症状抑或表面上没有Fabry病其它特征性症状的非典型性变异型Fabry病，与左心室肥大和心脏病有关Nakano等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med)333288-293，(1995)。α-Gal A的降低可能是这些心脏异常的病因。
已经分离得到了编码人α-Gal A的cDNA和基因并进行了测序。人α-Gal A是作为429个氨基酸的多肽表达的，其N末端31个氨基酸为信号肽。人的这种酶已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中(Desnick等人，美国专利5,356,804；Ioannou等人，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)1191137，(1992))和昆虫细胞中(Calhoun等人，WO 90/11353)得到表达。
然而，目前的α-Gal A制剂的功效有限。高纯度α-Gal A的制备方法依赖于使用的亲和层析法，即植物凝血素亲和层析法(伴刀豆球蛋白A(ConA)Sepharose)和基于将α-Gal A与Sepharose基质偶联的底物类似物N-6-氨基己酰基-α-D-半乳糖基胺的结合的亲和层析法的联合。参阅例如，Bishop等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)256.1307-1316，1981)。使用蛋白质性质的植物凝血素亲和树脂和底物类似物树脂通常与亲和剂从固相支持物连续脱落有关(Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.)201306-310，1992)，导致纯化产物中污染了在溶液中游离的或结合了洗脱蛋白质的亲和剂。这些污染使产物不适合用于制药学制剂。结合的底物类似物和植物凝血素也可能对蛋白质的酶学、功能性、和结构特性具有实质性的消极影响。此外，用以前的方法制备的α-Gal A在肝脏中被快速清除。
因此，本领域仍然需要使用传统层析树脂的纯化方案，这种树脂可以从供应商处容易地获得，质量适用于大剂量商业用途，而且产生的α-Gal A制剂，不含亲和剂。另外，本领域仍然需要循环半衰期延长、在肝脏以外的特定组织中的摄取增加的α-Gal A制剂。
发明概述本发明提供了高纯度的α-Gal A制剂及用于纯化α-Gal A糖形式的多种方法。本发明还提供了电荷改变的α-Gal A制剂及其制备方法。电荷变化是通过增加α-Gal A的唾液酸含量和/或增加α-Gal A的磷酸化来实现的。本发明还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α-Gal A制剂及其制备方法。最后，本发明还提供了对受治疗者施用α-Gal A制剂的方法和剂量。本发明的α-Gal A可用于治疗Fabry病患者或Fabry病非典型性变异型患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群，诸如心室膨大，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全；或者主要为肾累及的患者)。
图的简述
图1表示用于从人成纤维细胞cDNA文库分离α-Gal A cDNA的210bp探针(SEQ ID NO1)。探针的序列来自α-Gal A基因的外显子7。该探针是通过聚合酶链反应(PCR)由人基因组DNA分离的。图中标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。
图2表示完成α-Gal A cDNA克隆5’端的DNA片段的序列(SEQ ID NO2)。此片段是通过PCR由人基因组DNA扩增的。标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。同时还标明了实施例1中所述亚克隆利用的NcoI和SacII限制性内切酶位点的位置。
图3表示了α-Gal A cDNA的序列，包括编码信号肽的序列(SEQ IDNO3)。
图4是α-Gal A表达构建物pXAG-16的示意图，包括CMV(细胞肥大病毒)启动子、第一个外显子、和第一个内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，α-Gal A的cDNA(缺α-Gal A信号肽序列)，和hGH3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。
图5是α-Gal A表达构建物pXAG-28的示意图，包括胶0原蛋白Iα2启动子和第一个外显子，β-肌动蛋白内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，α-Gal A的cDNA(缺α-Gal A信号肽序列)，和hGH 3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。
图6表示了人α-Gal A氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图7表示了编码人α-Gal A的cDNA序列(无信号肽)(SEQ ID NO5)。
图8是使用丁基Sepharose树脂的α-Gal A纯化步骤的层析图谱。显示了选定的收集液在280nm处的吸光率(普通线)和α-Gal A活性(打点线)。
图9是pGA213C的示意图。
图10是靶向构建物pGA213C及其与内源α-半乳糖苷酶A基因座进行同源重组的图解。将pGA213C描述成靶向序列，排列于X染色体α-半乳糖苷酶A基因座的相应序列的上面。在线性图谱上面的数字表示的是相对于甲硫氨酸起始密码子ATG的位置。在第-221位的上面显示了含有通过DNA克隆插入该处的鼠dhfr、细菌neo、和CMV启动子/醛缩酶内含子序列的激活单位。α-半乳糖苷酶A编码序列由深色盒表示。α-半乳糖苷酶A非编码基因组序列由浅色盒表示。大箭头表示dhfr和neo表达盒的转录方向。激活的α-半乳糖苷酶A(GA-GAL)基因座图谱下面的分段线表示成功靶向和基因活化后的GA-GAL mRNA剪接。
发明详述序言此处所述的发明涉及一些新的α-Gal A制剂及其生产方法，以及使用这些制剂治疗Fabry病或非典型性变异型Fabry病患者的方法。下文概述和更详细地说明了某些受到关注的代表性实施方案。
本发明将在任何细胞(α-Gal A生产细胞)中生产的α-Gal A用于Fabry病的治疗。在优选的实施方案中，本发明使用由标准基因工程技术(基于将克隆的α-Gal A基因或cDNA导入宿主细胞)或基因活化方法生产的人α-Gal A。
本发明提供了含有纯度高于在现有技术中制备的α-Gal A的制剂及其生产方法。如SDS-PAGE或反相HPLC所测量，使用本发明的纯化方法，人α-Gal A制剂组合物优选地纯化到至少98％同质性，更优选地至少99％同质性，最优选地至少99.5％同质性。本发明的α-Gal A制剂的比活性优选地至少2.0×106单位/mg蛋白质，更优选地至少3.0×106单位/mg蛋白质，最优选地至少3.5×106单位/mg蛋白质。
在一个实施方案中，在疏水相互作用树脂上将各种糖形式的α-Gal A与其它成分分开，由此纯化α-Gal A制剂，但是不包括植物凝血素层析步骤。在优选的实施方案中，疏水相互作用树脂的功能部分包括丁基。
在备选的实施方案中，首先在层析柱中于平衡缓冲液中酸性pH下使各种糖形式的α-Gal A结合到阳离子交换树脂上，然后用平衡缓冲液清洗层析柱，洗脱未结合的物质，并使用10-100mM的盐溶液、pH4-5的缓冲液、或其组合作为洗脱液洗脱各种糖形式的α-Gal A，由此纯化α-Gal A制剂。在优选的实施方案中，平衡缓冲液的pH为大约4.4。
在另一个备选的实施方案中，用包括层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、或免疫亲和层析法中的至少一个方法的纯化步骤，将样品中的各种糖形式的α-Gal A与样品中的其它成分分开，从而纯化了α-GalA制剂。
本发明还提供了α-Gal A电荷改变的α-Gal A制剂及其生产方法。制剂可能包括不同糖形式的α-Gal A。电荷的改变是通过增加α-Gal A制剂中的唾液酸含量和/或增加α-Gal A制剂的磷酸化程度来实现的。
α-Gal A制剂中的唾液酸含量是如下增加的(i)在纯化过程之中或之后分离高电荷和/或高分子量的糖形式的α-Gal A；(ii)使用经遗传修饰的细胞(通过传统的基因工程方法或基因活化方法)表达唾液酰基转移酶基因或cDNA来添加唾液酸残基；或(iii)在低铵环境发酵或培养表达该酶的细胞。
如下增加α-Gal A制剂的磷酸化(i)使用经遗传修饰的细胞来(通过传统的基因工程方法或基因活化方法)表达磷酸转移酶基因或cDNA，添加磷酸残基；或(ii)向培养细胞加入磷酸酶抑制剂。
使用本发明的方法，获得了人的糖基化α-Gal A制剂，其中35％-85％的寡糖带电荷。在优选的实施方案中，至少35％的寡糖带电荷。在更优选的实施方案中，至少50％的寡糖带电荷。
可供选择的优选的人糖基化α-Gal A制剂具有多种α-Gal A糖形式，其中优选地至少20％，更优选至少50％，最优选至少70％使聚糖与2-4个唾液酸残基复合。在可供选择的优选的实施方案中，具有多种糖形式的人糖基化α-Gal A制剂的寡糖电荷如Z数目测量所得，大于100，优选地大于150，更优选地大于170。在另一个可供选择的优选的实施方案中，具有多种糖形式的人糖基化α-Gal A制剂平均至少16-50％，优选地25-50％，更优选地至少30％磷酸化。在另一个可供选择的实施方案中，具有多种糖形式的制剂中，50-75％，优选地60％的总聚糖唾液酸化。
在本发明的一个实施方案中，生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的步骤如下首先将编码GlcNAc转移酶III(GnT-III)的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞或者通过同源重组导入调控序列以调控内源GnT-III基因的表达；然后在能够表达α-Gal A和GnT-III的培养条件下培养α-Gal A生产细胞；最后分离寡糖电荷增加的α-Gal A制剂。
在本发明的备选实施方案中，生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的步骤如下首先将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入生产的α-Gal A细胞或者通过同源重组导入调控内源唾液酰基转移酶基因的表达的调控序列；然后在能够表达α-Gal A和唾液酰基转移酶的培养条件下培养α-Gal A生产细胞；最后分离寡糖电荷增加的α-Gal A制剂。优选的唾液酰基转移酶包括α2，3-唾液酰基转移酶和α2，6-唾液酰基转移酶。该方法在优选的实施方案中，包括通过制剂的分级分离或纯化来选择大小或电荷增加的α-Gal A糖形式的额外步骤。
在另一个实施方案中，获得唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的步骤如下将α-Gal A生产细胞接触铵浓度低于10mM的培养基，更优选地铵浓度低于2mM。在优选的实施方案中，低铵环境是通过向培养基中加入谷氨酰胺合成酶来兑现的。在备选的优选的实施方案中，低铵环境是通过用新鲜培养基连续或间歇灌注α-Gal A生产细胞以维持铵浓度低于10mM(优选地低于2mM)来实现的。
在另外的一个实施方案中，获得磷酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的步骤如下首先将编码磷酸转移酶的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞或者通过同源重组导入调控内源磷酸转移酶基因表达的调控序列；然后在能够表达α-Gal A和磷酸转移酶的培养条件下培养上述α-Gal A生产细胞；最后分离磷酸化程度比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A更大的α-Gal A制剂。在优选的实施方案中，由本发明方法生产的α-GalA制剂具有多种糖形式，其中的16-50％，优选地25-50％，更优选地至少30％的糖形式是磷酸化的。在优选的实施方案中，该方法包括通过分离或纯化制剂来选择大小或电荷增加的α-Gal A糖形式的额外步骤。
在另外的一个实施方案中，磷酸化增加的糖基化α-Gal A制剂是通过向培养细胞中加入磷酸酶抑制剂(如溴四咪唑)获得的。在用作培养细胞的生长添加剂的胎牛血清中可以存在低水平的牛血浆碱性磷酸酶。这增加了分泌的α-Gal A上暴露的Man-6-P表位成为血浆碱性磷酸酶底物的可能性。已经显示，溴四咪唑是碱性磷酸酶的潜在抑制剂，Ki＝2.8mM(Metaye等人，生化药理学(Biochem.Pharmacol.)154263-4268，1988))；并在0.1mM浓度时达到完全抑制(Borgers和Thone，组织化学(Histochemistry)44277-280，1975)。因此，在一个实施方案中，可以在培养的细胞中加入磷酸酶抑制剂(如溴四咪唑)，从而通过预防Man-6-P酯基的水解使得存在于培养基中的α-Gal A的高摄取形式最大化。
本发明还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α-Gal A制剂及其生产方法。增强循环半衰期和细胞摄取的步骤如下(i)增加α-GalA的唾液酸含量(如上兑现)；(ii)增加α-Gal A的磷酸化(如上兑现)；(iii)PEG化α-Gal A；或(iv)相继除去α-Gal A寡糖链上的唾液酸和末端半乳糖残基，或除去末端半乳糖残基。
改善的α-Gal A制剂的唾液酸化也增强了外源α-Gal A的循环半衰期。另外，相对于肝细胞而言，非肝细胞中改善的α-Gal A的唾液酸化也增强了α-GalA的摄取，这些非肝细胞如肝内皮细胞、肝血窦细胞、肺细胞、肾细胞、神经细胞、内皮细胞、或心细胞。唾液酸含量增加的人糖基化α-Gal A制剂优选包括多种糖形式，其中至少20％的复合聚糖含2-4个唾液酸残基。备选的优选人糖基化α-Gal A制剂也具有多种糖形式，其中50-75％，优选地至少60％的总聚糖唾液酸化。
α-Gal A制剂的磷酸化也提高了进入细胞的α-Gal A水平。磷酸化是在表达α-Gal A的细胞内发生的。本发明的优选人糖基化α-Gal A制剂优选地包括多种糖形式，其中至少平均16-50％的糖形式磷酸化，优选地25-50％，更优选地至少30％。
在备选的实施方案中，α-Gal A与聚乙二醇复合增强了人α-Gal A制剂的循环半衰期。在优选的实施方案中，α-Gal A制剂是通过与tresyl单甲氧基PEG(TMPEG)复合形成PEG化α-Gal A。然后将它纯化提供了分离的PEG化α-Gal A制剂。PEG化α-Gal A加长了蛋白质的循环半衰期，增强了体内功效。
唾液酸化影响蛋白质的循环半衰期和生物分布。含微量唾液酸或不含唾液酸的蛋白质容易通过蛋白质上暴露的半乳糖残基由肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体(Ashwell受体)进行内在化。以半乳糖结尾的α-Gal A的循环半衰期可以如下步骤按序增强(1)让α-Gal A接触神经氨酸苷酶(唾液酸酶)除去唾液酸，由此暴露末端半乳糖部分，并(2)使脱唾液酸α-Gal A接触β-半乳糖苷酶除去末端半乳糖苷残基。产生的α-Gal A制剂的寡糖链上的末端唾液酸和/或末端半乳糖苷残基数目比未相继接触神经氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶的α-Gal A制剂的寡糖链上的少。或者，让脱唾液酸α-Gal A只接触β-半乳糖苷酶，除去末端半乳糖苷残基而增长半乳糖结尾的α-Gal A的循环半衰期。产生的α-Gal A制剂的寡糖链上的末端半乳糖苷残基数目比未接触β-半乳糖苷酶的α-Gal A制剂少。在优选的实施方案中，在先后接触神经氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶后，再让产生的α-Gal A制剂接触β-氨基己糖苷酶，从而将寡糖切至三甘露糖核。
另外，唾液酸化水平可以根据所用的细胞类型而变化。因此，在另一个优选的实施方案中，α-Gal A的唾液酸化是通过筛选唾液酰基转移酶活性相对较高的哺乳动物细胞(如人细胞)并利用这些细胞作为α-GalA生产细胞而增强的。
本发明还提供了基本上不含非α-Gal A蛋白质(诸如清蛋白、宿主细胞产生的非α-Gal A蛋白质、或从动物组织或流体分离的蛋白质)的α-Gal A制剂的配方。在一个实施方案中，配方还包括赋形剂。优选的赋形剂包括甘露醇、山梨醇、甘油、氨基酸、脂类、EDTA、EGTA、氯化钠、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、葡聚糖、或这些赋形剂的任意组合。在另一个实施方案中，配方还包含非离子去污剂。优选的非离子去污剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、屈立通X-100、屈立通X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡萄糖苷、辛基β-葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、和吐温20。在优选的实施方案中，非离子去污剂包括聚山梨酯20或聚山梨酯80。优选的配方还包括磷酸盐缓冲液，pH优选地为6。
本发明还提供了对受治疗者施用α-Gal A制剂的方法。在优选的实施方案中，α-Gal A制剂是本文所述电荷改变(如寡糖电荷增加)和/或循环半衰期延长的α-Gal A制剂。施用剂量优选地每kg体重0.05-5.0mg，更优选地每kg体重0.1-0.3mg，α-Gal A制剂，一周一次或两周一次。在优选的实施方案中，施用剂量可以每kg体重约0.2mg，两周一次。在这些方法中，可以如下施用通过肌肉内、口、直肠、皮下、动脉内、腹膜内、大脑内、鼻内、真皮内、鞘内、穿粘膜、穿真皮、或吸入。在一个实施方案中，向受治疗者投递α-Gal A制剂的方法包括两周一次或一周一次每kg体重皮下施用0.01-10.0mg，优选地0.1-5.0mgα-Gal A制剂。α-Gal A制剂也可以静脉内施用，如静脉内大剂量注射、慢推静脉内注射、或连续静脉内注射。在任何上述方法中，α-Gal A制剂可以使用投递系统投递，诸如泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针头投递注射、无针头注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和透皮贴。任何上述α-Gal A制剂可以使用这些方法施用。
使用上述施用方法和剂量，α-Gal A制剂可以治疗怀疑患有或已知患有Fabry病的个体。本发明关注对Fabry病患者(“Fabry患者”)以及非典型性变异型Fabry病患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群，本文中定义为心室膨大的Fabry患者，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全，或者主要为肾累及的患者)的治疗。α-Gal Aα-Gal A是从糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的同型二聚体糖蛋白。
术语成熟的“α-Gal A”和“GA-GAL”和SEQ ID NO5”(见图7)指不含信号肽的α-Gal A(对于含信号肽的α-Gal A，见图3和SEQ ID NO3)。如本文中定义的，术语“α-Gal A制剂”可与术语“糖基化α-GalA制剂”互换使用，而且包括各种糖基化的α-Gal A糖形式。
“信号肽”指将该信号肽与之连接的新合成的肽引向内质网(ER)进行进一步的翻译后加工和分布的肽序列。
如本文中对α-Gal A的论述中所用，“异源信号肽”指非人α-Gal A信号肽，通常是除α-Gal A之外的一些哺乳动物蛋白质的信号肽。
技术人员会认识到，人α-Gal A DNA序列(cDNA[SEQ ID NO5]或基因组DNA)或者因沉默密码子变化或产生保守性氨基酸替代的密码子变化而与人α-Gal A DNA不同的序列可以用于遗传修饰培养人细胞，使得细胞过度表达并分泌本酶。α-Gal A序列中的某些突变可以编码保留了或展示改善的α-Gal A酶活性的多肽。比如说，特别是如果它们占蛋白质总残基数的比率低于10％，技术人员将期望保守性氨基酸替代对生物学活性影响较小或没有影响。保守性替代通常包括下列几组中的替代甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。参阅，例如美国专利5,356,804，引入本文作为参考。Fabry病Fabry病是由酶α-Gal A的活性缺陷引起的遗传性紊乱。“α-Gal A缺陷”指患者中该酶的量或活性的缺乏导致中性糖脂(如globotriaosylceramide)在血管壁组织细胞中积累异常，伴随大腿、臀部、和生殖器上的血管角质瘤，少汗，四肢感觉异常，角膜轮生，和辐状后囊下内障。该物质的沉积可以导致疼痛、严重的肾和心血管疾病、和中风。正如通常在Fabry病男性患者中观察到的糖脂的积累会诱导严重的症状。或者如在缺陷基因的杂合子女性携带者中有时看到的，积累诱导相对微弱的症状。受影响个体的期望寿命大大缩短；常常大约40岁就因肾、心、或脑血管并发症而死亡。这种疾病没有特异性治疗。归类为溶酶体贮积紊乱的Fabry病患者在全世界有15,000人以上。
上文定义的Fabry病是一种复杂的临床综合症，特征是涉及多器官和多系统。患有角膜营养不良、皮肤病变(血管角质瘤)、痛苦的神经病、脑血管疾病、心肌病、和肾功能障碍全部病症的患者归为“典型性”表型。而一些没有全部典型性表型的患者归为“Fabry病非典型性变异型”。存在几种与α-半乳糖苷酶A缺陷有关的非典型性变异型表型。例如，一些α-半乳糖苷酶A缺陷患者患有只涉及心的变异型Fabry病，如左心室肥大(LVH)。还存在只涉及肾的另一种变异型表型。虽然在男性半合子中已经确认了这两种变异型表型，但是同样在女性杂合子中也已经有变异型Fabry病的报道。
非典型性心变异型患者通常在生命后期患有症状性疾病。心变异型表型患者的诊断的平均年龄大约是52岁，而典型性表型大约是29岁(Desnick等人，在《遗传性疾病的代谢和分子基础》(The Metabolic andMolecular Bases of Inherited Disease)中，第6版，1996，Scriver等人(编)，McGraw-Hill，纽约，第2741-2784页；Meikle等人，美国医学学会会刊(J.Am.Med Assoc.) 281249-254，1999)。这种综合症的患者通常存在微弱的心功能障碍症状，诸如劳力性呼吸困难。通常，标准回声心动图分析表明，心变异型表型患者左心室肥大(LVH)或中隔不对称肥大。然而，患者还可能有心肌梗死或心肌病(Scheidt等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)324395-399，1991；Nakao等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)333288-293，1995))。这些患者经常进行心肌活组织检查，表明变异型综合症的病理学与典型性Fabry病(贮积的糖脂浸润心肌)基本相似。这些患者的α-半乳糖苷酶A酶实验发现酶水平的范围很广。例如，有报导，心变异型患者的α-半乳糖苷酶A酶活性高达正常水平的30％，因此，至今尚未考虑作为α-Gal A取代疗法的候选疗法。
本发明人现在已经出人意料地发现，虽然非典型性心变异型或非典型性肾变异型患者的α-半乳糖苷酶A酶活性水平可能比典型性Fabry病表型患者高，但是这些患者也可以受益于α-半乳糖苷酶A酶疗法。例如，患者可以具有在细胞中产生动力学不稳定的α-Gal A酶的突变，而且对这些患者施用本发明的α-Gal A制剂显著提高了α-Gal A酶水平。同样，据报导，一些非典型性心变异型表型患者的α-半乳糖苷酶A第215位氨基酸具有点突变。而未突变蛋白质中的该氨基酸是糖基化的天冬酰胺(Eng等人，美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)531186-1197，1993)。由此，使用本发明的适当糖基化的α-半乳糖苷酶A制剂的α-Gal A酶取代疗法在这些患者中可能是有效的。此外，已有报导，发现了唯一的Fabry病临床表现是微弱的蛋白尿的非典型性肾突变型患者。然而，肾活组织检查发现了Fabry病的典型性糖脂内含物，而α-Gal A酶实验发现其酶水平低于正常α-Gal A水平。然而，因为在这些患者的尿沉淀物中的脱落肾小管细胞中可以检测到肾中贮积的酰基鞘氨醇己三糖苷，所以施用本发明的α-Gal A制剂可以实质性的降低这些水平。通过与甘露糖-6-磷酸(M6P)受体的相互作用可以将溶酶体酶(诸如α-Gal A)靶向细胞的溶酶体腔，M6P受体结合定位于溶酶体腔的酶的寡糖部分中存在的M6P残基(Kornfeld和Mellman，细胞生物学年鉴(Ann.Rev.Cell Biol.)5483-525，1989)。初级相互作用发生于高尔基体中，结合高尔基体M6P受体的酶被分离并转运至溶酶体。可以相信第二种相互作用发生于细胞外α-Gal A与位于细胞表面的M6P受体之间。不在常规系统中的酶是经组成性分泌途径被细胞分泌的，而且常常被细胞表面M6P受体再次捕获，通过内吞途径使α-半乳糖苷酶A返回溶酶体。经内在化的细胞外物质在内吞小泡中转运穿过细胞质，内吞小泡与初级溶酶体融合，并将其内容物全部输入溶酶体中。在此过程中，细胞表面M6P受体也掺入到内吞小泡中并转运至溶酶体中。具体地说，高水平唾液酸化和/或磷酸化的本发明α-Gal A制剂在治疗Fabry病非典型性变异型患者时特别优选。这样的制剂例如能够使从肝细胞清除的注射入α-Gal A部分最小化，并使得非肝细胞能够摄取高水平的α-Gal A，诸如肾细胞、血管细胞、肾小管细胞、肾小球细胞、心肌细胞、和心血管细胞。
携带M6P残基的细胞外α-Gal A可以结合细胞表面M6P受体，并转运进入溶酶体腔。一旦进入溶酶体腔，α-Gal A就可以发挥适当功能。正是溶酶体酶转运使得α-半乳糖苷酶A酶取代疗法成为治疗Fabry病患者的可行方法。由此，甚至当细胞有α-Gal A生成遗传缺陷时，如果α-Gal A是适当糖基化的，且缺陷细胞携带M6P受体，那么细胞仍可以摄取细胞外α-Gal A。在Fabry病患者中，肾和心的血管内皮细胞严重地组织病理学异常，且造成该疾病的临床病理。携带M6P受体的这些细胞是α-Gal A的特殊治疗靶。本发明的一个目的是提供M6P存在于N-连接寡糖中的α-Gal A制剂。
α-Gal A的N-连接寡糖的唾液酸化修饰程度对α-Gal A药物动力学和生物学分布具有实质性影响。当没有适当的唾液酸化时，由于结合肝唾液酸化蛋白质受体(Ashwell受体)α-Gal A在肝细胞内在化并降解后，经循环系统快速清除(Ashwell和Harford，生化年鉴(Ann.Rev.Biochem.)51531-554，1982)。这降低了循环系统中可获得的、结合诸如肾和心的血管内皮细胞上的M6P受体的α-Gal A的量，造成了Fabry病的临床病理。经遗传修饰的人细胞分泌的α-Gal A具有适于治疗Fabry病的糖基化特性，可以通过纯化的分泌型蛋白质的传统制药学方法施用，抑或通过基因治疗而不需要额外酶修饰。据已有的报导，溶酶体酶葡糖脑苷脂酶需要这种修饰，其中临床相关细胞摄取纯化的葡糖脑苷脂酶需要在从人胎盘纯化之后对酶进行复杂的修饰(Beutler，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)3251354-1360，1991)。适用于α-Gal A生产的细胞怀疑患有α-Gal A缺陷(诸如Fabry病)的个体可以用从培养的、经遗传修饰的细胞(优选地人细胞)获得的纯化的人α-Gal A进行治疗。
在以治疗Fabry病为目的而对细胞进行遗传修饰时，细胞可以通过传统的遗传工程方法或通过基因激活方法来修饰。
按照传统方法，含有α-Gal A cDNA或基因座DNA序列的DNA分子，可以包含在表达载体构建体中，并通过标准方法转化到初生、次生、或永生细胞中，标准方法包括(但不限于)脂质体、聚凝胺、或DEAE葡聚糖介导的转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、或速度驱动的微弹(“biolistics”)(参阅，如同样悬而未决的USSN 08/334,797，此处引入作为参考)。技术人员或者可以使用通过病毒载体投递遗传信息的系统。已知可用于基因转移的病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、逆转录病毒、Sindbis(辛德毕斯)病毒、和牛痘病毒(诸如金丝雀痘病毒)。
或者，利用基因激活(“GA”)方法修饰细胞，诸如美国专利5,733,761和5,750,376所述，引入本文中作为参考。本文将基因激活产生的α-GalA称为GA-GAL。
因此，如本文所用，对于细胞，术语“遗传修饰”包括导入编码基因产物的DNA分子和/或控制基因产物编码序列表达的调控元件后表达特定基因产物的细胞。可以通过基因靶向或同源重组导入DNA分子，即在特定基因座位点导入DNA分子。同源重组可以用于取代缺陷基因自身。在Fabry病患者自身细胞中，可以用完整基因或其一部分取代缺陷型α-Gal A基因或其一部分。
如本文中所用，术语“初生细胞”包括从脊椎动物组织分离的细胞悬浮液中存在的细胞(在铺板即吸附组织培养基质之前，诸如培养皿或培养瓶)，从组织得到的外植体中存在的细胞，第一次铺板的上述细胞种类，和从这些铺板细胞得到的细胞悬浮液。
“次生细胞”指处于所有培养开始后步骤中的细胞。换言之，第一次由培养基质上取下铺板的初生细胞并再次铺板(传代)，将之称为次生细胞，正如随后传代中的所有细胞。
“细胞株”包括已经传代一次或多次；在培养中展示有限次数的平均群体倍增；展示接触抑制、依赖贴壁的生长特性(除了在悬浮培养中繁殖的细胞)；且不是永生的次生细胞。
“永生细胞”指源自培养中表观上寿命不受限制的已建立细胞系的细胞。
初生或次生细胞的例子包括成纤维细胞、上皮细胞(包括乳房和肠上皮细胞)、内皮细胞、血液的组成元素(包括淋巴细胞和骨髓细胞)、胶质细胞、肝细胞、角质细胞、肌细胞、神经细胞、或这些细胞类型的前体。用于本方法的永生人细胞系的例子包括(但不限于)Bowes黑素瘤细胞(ATCC登记号CRL 9607)、Daudi细胞(ATCC登记号CCL 213)、HeLa细胞及其衍生物(ATCC登记号CCL 2、CCL 2.1、和CCL 2.2)、HL-60细胞(ATCC登记号CCL 240)、HT-1080细胞(ATCC登记号CCL 121)、Jurkat细胞(ATCC登记号TIB 152)、KB癌细胞(ATCC登记号CCL 17)、K-562白血病细胞(ATCC登记号CCL 243)、MCF-7乳癌细胞(ATCC登记号BTH 22)、MOLT-4细胞(ATCC登记号1582)、Namalwa细胞(ATCC登记号CRL 1432)、Raji细胞(ATCC登记号CCL 86)、RPMI 8226细胞(ATCC登记号CCL 155)、U-937细胞(ATCC登记号CRL 1593)、WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC登记号CLL 75.1)、CCRF-CEM细胞(ATCC登记号CCL 119)、和2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick等人，癌症研究(CancerRes.)485927-5932，1988)，以及通过人细胞与其它物种细胞的融合产生的异种杂交瘤细胞。
在对人细胞进行遗传修饰产生分泌α-Gal A的细胞后，可以产生基本上由遗传性状相同的已培养的初生永生人细胞集合组成的无性繁殖细胞株，即一个基本上由遗传性状相同的永生人细胞集合组成的无性繁殖细胞系。有一个实施方案中，无性繁殖细胞株或无性繁殖细胞系的细胞是成纤维细胞。另一个优选的实施方案中，细胞是次生人成纤维细胞，如BRS-11细胞。
在经遗传修饰后，培养细胞培养条件允许分泌α-Gal A。从培养细胞分离蛋白质步骤如下收集使细胞生长的培养基和/或裂解细胞以释放其内容物，然后应用蛋白质纯化技术，得到蛋白质。从稳定转染的细胞的已调节好的培养基纯化α-Gal A按照本发明的方法，从培养细胞(“α-Gal A生产细胞”)分离α-GalA蛋白质步骤如下收集生长细胞的培养基和/或裂解细胞以释放其内容物，然后应用不使用植物凝血素亲和层析的蛋白质纯化技术纯化蛋白质。优选的纯化过程在下文实施例2中有概述。
备选的疏水相互作用树脂，诸如Source Iso(Pharmacia)、Macro-PrepMethyl Support(Bio-Rad)、TSK Butyl(Tosohaas)、或Phenyl Sepharose(Pharmacia)，也可以用于纯化α-Gal A。层析柱可以用浓度相对较高的盐(如1M硫酸铵或2M NaCl，于pH5.6的缓冲液中)平衡。待纯化的样品是通过调至平衡缓冲液的pH和盐浓度制备的。将样品加至层析柱，并用平衡缓冲液清洗层析柱以除去未结合物质。α-Gal A是用离子强度较低的缓冲液、水、或溶于水的有机溶剂(如20％乙醇或50％丙二醇)从层析柱中洗脱得到的。或者，使用盐浓度较低的平衡缓冲液和样品或使用不同pH，让α-Gal A流过层析柱。其它蛋白质可能与层析柱结合，使含α-Gal A的样品不与层析柱结合，获得纯化。第一步纯化步骤优选使用羟基磷灰石层析柱。
备选的纯化过程可以使用阳离子交换树脂，如SP Sepharose6FastFlow(Pharmacia)、Source 30S(Pharmacia)、CM SepharoseFast Flow(Pharmacia)、Macro-PrepCM Support(Bio-Rad)、或Macro-PrepHighS Support(Bio-Rad)，来纯化α-Gal A。“第一步层析步骤”是第一次将样品加于层析柱(不包括与样品制备有关的所有步骤)。α-Gal A能够结合pH4.4的层析柱。诸如10mM醋酸钠(pH4.4)、10mM柠檬酸钠(pH4.4)、或在大约pH4.4具有适当缓冲能力的其它缓冲液可以用来平衡层析柱。将待纯化样品的pH和离子强度调至与平衡缓冲液一样。将样品加于层析柱，并在加样后清洗层析柱以除去未结合物质。诸如NaCl或KCl等盐可以用于从层析柱洗脱α-Gal A。或者，可以用更高pH或更高盐浓度更高pH的缓冲液从层析柱洗脱α-Gal A。α-Gal A也可以通过在加样过程中增加平衡缓冲液和样品中的盐浓度，通过在较高pH进行层析，或者通过高盐高pH组合，使流经层析柱。
纯化的另一步可以使用Q Sepharose6 Fast Flow来纯化α-Gal A。Q Sepharose6 Fast Flow是相对较强的阴离子交换树脂。较弱的阴离子交换树脂，诸如DEAE SepharoseFast Flow(Pharmacia)或Macro-PrepDEAB(Bio-Rad)，也可以用于纯化α-Gal A。层析柱是用如10mM磷酸钠(pH6)等缓冲液平衡的。将样品的pH调至pH6，并通过稀释或渗滤样品达到低离子强度。将样品加到能够结合α-GalA的条件下的柱上，用平衡缓冲液清洗层析柱以除去未结合物质。用如NaCl或KCl等盐或者用较低pH缓冲液或者高盐低pH组合洗脱α-Gal A。通过在加样过程中增高加载物的盐浓度，在较低pH进行层析，或者在高盐低pH组合中层析，也可以让α-Gal A流经层析柱。
另一纯化步骤使用Superdex200(Pharmacia)大小排阻层析纯化α-Gal A。其它大小排阻层析树脂，诸如SephacrylS-200 HR或Bio-GelA-1.5cm，也可用于纯化α-Gal A。大小排阻层析的优选缓冲液是含0.05M NaCl的25mM磷酸钠(pH6.0)。其它与配方兼容的缓冲液也可以利用，如10mM柠檬酸钠或柠檬酸钾。缓冲液的pH可以在pH5与pH7之间，而且应当含有盐，如NaCl或NaCl与KCl的混和物。
还有一个纯化方法使用层析聚焦树脂纯化α-Gal A，诸如PolybufferExchanger PBE 94(Pharmacia)。在较高pH(如pH7.0或以上)平衡层析柱，将待纯化样品的pH调至相同pH，并将样品加于层析柱上。蛋白质是用pH已调至4的Polybuffer 74(Pharmacia)等缓冲液系统，洗脱带有逐渐降低至诸如4的pH的pH梯度。
或者可以利用免疫亲和层析纯化α-Gal A。可以将针对α-Gal A的适当的多克隆或单克隆抗体(使用标准技术，使用α-Gal A或由α-Gal A序列衍生的肽进行免疫而产生)固定在激活偶联的树脂上，如NHS激活的Sepharose4 Fast Flow(Pharmacia)或CNBr激活的Sepharose4Fast Flow(Pharmacia)。将待纯化样品加于pH约为6或7的固定了抗体的层析柱上。清洗层析柱以除去未结合物质。用亲和层析采用的典型试剂诸如低pH(如pH3)、变性剂(如胍-HCl或硫氰酸盐)、或有机溶剂(如溶于pH6的缓冲液的50％丙二醇)从层析柱洗脱α-Gal A。纯化过程还可以使用金属螯和物亲和树脂如Chelating SepharoseFast Flow(Pharmacia)来纯化α-Gal A。预先用金属离子如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、或Cd2+使层析柱带电荷。将待纯化样品加于pH适当的(如pH6-7.5)的层析柱，并清洗层析柱以除去未结合的蛋白质。利用咪唑或组氨酸的竞争性洗脱，或利用柠檬酸钠或柠檬酸钾将pH降低至6以下，或者利用诸如EDTA或EGTA等螯合剂，洗脱结合的蛋白质。
按照上述方案，本发明提供了比以前技术制备的含更高纯度的α-GalA的制剂，如由SDS-PAGE或反相HPLC测量的纯度至少98％同质性，更优选地至少99％同质性，最优选地至少99.5％同质性。本发明的α-Gal A制剂可以含有多种α-Gal A糖形式。因此，如本文中α-Gal A制剂章节所用，术语“同质性”指基本上不含(＜2％总蛋白质)α-Gal A以外的蛋白质的制剂。非α-Gal A蛋白质的例子诸如清蛋白、由宿主细胞产生的非α-Gal A蛋白质、和由动物组织或流体分离的非α-Gal A蛋白质。本发明α-Gal A制剂的比活性优选地至少2.0×l06单位/mg蛋白质，更优选地至少3.0×l06，最优选地至少3.5×106单位/mg蛋白质。通过聚糖改造增加寡糖电荷增长α-Gal A制剂的循环半衰期本发明提供了提高肝和巨噬细胞以外的特定组织摄取治疗性酶的糖蛋白修饰程序。使用本发明的方法，得到了人糖基化α-Gal A制剂，其中35-85％的寡糖带电荷，优选地至少50％的寡糖带电荷。
蛋白质N-糖基化通过修饰寡糖结构的适当天冬酰胺残基起作用，影响其特性和生物学活性(Kukuruzinska和Lennon，口生物学和医学评论(Crit.Rev.Oral.Biol.Med.)9415-448，1998)。本发明提供了分离的α-Gal A制剂，其中主要是通过在复合聚糖上添加1-4个唾液酸残基，在高甘露糖聚糖上添加1-2个磷酸部分，或者在杂合聚糖上添加1个磷酸和1个唾液酸使高百分率的寡糖带负电荷。还存在较少数量的硫酸化复合聚糖。高比率的带电荷结构具有两个主要功能。第一，通过2，3-或2，6-连接的唾液酸掩盖倒数第二个半乳糖残基，由此防止通过肝细胞上的唾液酸糖蛋白受体从循环中过早清除。该受体识别含末端半乳糖残基的糖蛋白。增长α-Gal A循环半衰期让重要靶器官(诸如心和肾)有机会在酶输液后从血浆中内吞更大数量的酶。第二，高甘露糖或杂合聚糖上存在Man-6-磷酸提供不依赖阳离子的Man-6磷酸受体(CI-MPR)一个受体介导的摄取机会。这种受体介导的摄取发生于许多细胞的表面，包括血管内皮细胞，这是CTH在Fabry患者中的主要储存位点。含两个M6P残基的酶分子与CI-MPR的亲和力大大高于含一个M6P残基的酶分子。表1提供了有代表性的聚糖结构。
表1.有代表性的聚糖结构二岔聚糖±Fucα1.6SAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，6\ |Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnSAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，3/四岔聚糖SAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，6\ ±Fucα1，6SAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，6\ |ManI3 1，4GlcNAcf3 1，4GlcNAc-AsnSAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，3/SAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，4/高甘露糖聚糖Manα1，2Manα1，6\Manα1，6\Manα1，2Manα1，3/ Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnManα1，2Manα1，2Manα1，3/磷酸化杂合聚糖P-Manα1，6\Manα1，6\Manα1，3/ Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnSAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，3/双磷酸化聚糖P-Manα1，2Manα1，6\Manα1，6\Manα1，3/ Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnP-Manα1，2Manα1，3/N-糖蛋白的生物合成涉及多种酶、糖基转移酶、和糖苷酶。这些酶中的大多数以有顺序、有组织的方式在内质网(ER)和高尔基体中发挥功能。相同多肽中的不同天冬酰胺残基可以用不同的寡糖结构修饰的事实增加了N-糖基化的复杂性，而各种蛋白质通过其碳水化合物部分的特征而相互区别。分子遗传学的最新进展促成了鉴定、分离、和分析N-糖基化基因。结果，显现出N-糖基化与其它细胞功能之间的相互关系的信息。
细胞中的N-连接糖蛋白加工是当在ER腔内向初生肽上的受体天冬酰胺加入一个单位的含Glc3Man9Nac2的寡糖链时开始。在多萜醇(一种链很长的脂肪醇)上构建了Glc3Man9GlcNAc2组成的十四糖寡糖链
Manα1，2Manα1，6\Manα1，6\Manα1，2Manα1，3/Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-PP-多萜醇Glcα1，2Glcα1，3Glcα1，3Manα1，2Manα1，2Manα1，3/在ER腔内这种寡糖是作为一个单位转移至初生肽上的受体天冬酰胺残基上的。相对于肽而言较大的聚糖可以指导蛋白质折叠。3个葡萄糖残基是寡糖已完成且已准备好由寡糖转移酶转移的信号。该酶还将转移未葡萄糖化的寡糖，但是只占完成链的一部分，因为这些是亚最佳底物。人的碳水化合物缺陷糖蛋白综合症的一种形式已经显示是由葡萄糖添加途径中的第一种酶多萜醇-P-GlcMan9GlcNAc2-PP-多萜醇葡萄糖转移酶的缺陷引起的，导致血清蛋白质的糖基化过低(Korner等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9513200-13205，1998)。除去3个葡萄糖残基并且构象正确后，将新合成的糖蛋白输出至高尔基体。根据蛋白质折叠后聚糖对高尔基体甘露糖苷酶的易接近性，聚糖链可以仍作为含5-9个甘露糖残基的高甘露糖链存在。或者，可以进一步加工聚糖链成三甘露糖核，并成为其它糖基转移酶的受体，通过加入更多的GlcNAc残基后再加入Gal、NeuAc、和Fuc形成复合链。第三种可能是，如果蛋白质含有恰好相距34、与高甘露糖链有正确空间相互关系的两个赖氨酸残基，则在1个或者有时2个甘露糖残基上添加GlcNacα-1-PO4(Cuozzo等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27321069-21076，1998)。用特定的酶除去连接α的GlcNAc后，产生了跨越高尔基体的网络中的M6P受体识别的末端M6P表位，然后将这些酶定位于间充质细胞起源的细胞中的溶酶体。
为了将α-Gal A尽可能多地定位到不同的组织，可以使用许多不同的碳水化合物结构(糖形式)。Matsuura等人，糖生物学(Glycobiology)8329-339，1998)报导，CHO细胞中产生的人α-Gal A上的聚糖结构中41％含高甘露糖聚糖，24％磷酸化。然而，唾液酸化复合聚糖水平只有11％。因此，2/3的复合链未唾液酸化，导致肝脏快速清除α-Gal A。在本发明人细胞中产生的α-Gal A中带电荷寡糖的百分率比过去的技术中CHO细胞中产生的α-Gal A高。例如，在本文中所述HT-1080细胞中合成的α-Gal A特别合适，因为在HT-1080细胞中产生的α-Gal A含有大约15％中性结构(高甘露糖和杂合物)、大约16％的磷酸化聚糖、和大约67％的含2-4个唾液酸残基的复合聚糖。因此，与CHO细胞中产生的α-Gal A相比，基本上所有的复合链发生唾液酸化。HT-1080细胞α-Gal A具有3个N-连接糖基化位点。2个位点在高尔基体中加工成复合聚糖，而第三个位点被高甘露糖聚糖占据，其中50％被溶酶体酶特异的磷酸化修饰产生单磷酸化和双磷酸化种类。
为了改造含N-连接聚糖链的蛋白质上的碳水化合物，本发明提供了4种方法。第一，通过在纯化过程中选择性分离糖形式来增加带电荷α-GalA的比率。本发明提供了通过在纯化过程之中和/或之后在层析柱树脂上分级分离α-Gal A种类来增加高度带电荷和较大分子量α-Gal A糖形式的比率的方法。高度带电荷的α-Gal A糖形式含有更多的唾液酸和/或更多的磷酸，而更大分子量的糖形式也将含有完全糖基化、最高度分支、且高度带电荷的种类。选择带电荷种类或者除去未糖基化、弱糖基化、或弱唾液酸化和/和磷酸化的α-Gal A种类，将导致含更多唾液酸和/或更多磷酸的α-Gal A糖形式群，由此提供具有更长半衰期和潜在治疗性功效的α-Gal A制剂。
此分离过程可以利用(但不限于)合适的层析柱树脂来纯化或分离α-Gal A。例如，可以利用(但不限于)阳离子交换树脂(诸如SP-Sepharose)、阴离子交换树脂(Q-Sepharose)、亲和树脂(肝素Sepharose、植物凝血素层析柱)、大小排阻层析柱(Superdex200)、和疏水相互作用层析柱(Butyl Sepharose)和本领域已知的其它层析柱树脂进行分离。
由于细胞中产生的α-Gal A是分子量和电荷不同的异源糖形式混和物，所以α-Gal A的从层析树脂中洗脱的峰相对较宽。在这些洗脱中，糖形式的特定分布方式取决于所用树脂的特性。例如，在大小排阻层析中，在洗脱曲线中较大的糖形式倾向于比较小的糖形式较早地洗脱出来。
在离子交换层析中，带较多负电荷的糖形式倾向于用比带较少负电荷的糖形式更大的亲和力结合带正电荷的树脂(诸如Q-Sepharose)，且由此倾向于在洗脱曲线的较晚期洗脱。相反，那些高度带负电荷的糖形式与带负电荷的树脂(诸如SP Sepharose)的结合比带较少负电荷的种类更不紧密，或者甚至根本不结合。
层析树脂上糖形式种类的分离可能受pH、离子强度、选择的缓冲盐、粘性、和/或其它参数(诸如树脂类型的选择)的影响。还可以优化从由层析柱中选择性地洗脱α-Gal A各种种类时使用的各种梯度洗脱类型(直线线性梯度或曲线，如指数梯度)或使用的系列短步骤洗脱以便分离α-Gal A。可以优化单独的或组合的所有这些因素以达到有效地分离糖形式。分级分离也可以在纯化过程完成后在为期望糖形式群体的分离和选择而进行了选择性优化的特定层析树脂上进行。
从分离的α-Gal A种类选择糖形式群体可以在分析了洗脱的α-Gal A糖形式后完成。可以通过多种技术分析洗脱峰，诸如(但不限于)SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳、分析性离子交换HPLC、和/或分析性大小排阻HPLC。可以选择大小或电荷特征接近期望的特定部分。选择可以在过程中的每一个层析步骤(逐渐获得期望的糖形式群)或限于特定的一步或几步(如果这一步或这几步的分离效果好)中进行。分级分离也可以在纯化过程完成之后在为分离和选择期望的糖形式群体而被选择性优化了的特定层析树脂上进行。
高度带电荷和/或分子量较大的α-Gal A糖形式的分离和选择可以对任何α-Gal A制剂进行，诸如通过传统遗传工程方法或通过基因激活(GA)方法遗传修饰的细胞来源的α-Gal A制剂。这也可以在提供了如上所述更高唾液酸化和磷酸化的优化系统中培养、或如下所述PEG化α-Gal A的细胞系上进行。
例如，在如上所述的α-Gal A纯化过程中，α-Gal A糖形式的分离可以在纯化过程的各个步骤中进行。在疏水树脂Butyl SepharoseFastFlow上，首先洗脱带最多电荷的α-Gal A糖形式，随后是电荷次多的种类。对于Heparin Sepharose，在洗脱峰中首先洗脱的也是带最多电荷的种类，随后是电荷次多的种类。用Q-Sepharose发生的情况相反，首先洗脱电荷最少的种类，随后是带最多电荷的糖形式。在Superdex200的大小排阻层析上，首先洗脱最大分子量的糖形式，随后是较小分子量、较少糖基化的α-Gal A种类。为了有效分离特定的α-Gal A糖形式群，可以组合多个层析步骤，根据不同的物理方法进行分离。例如，为了获得pI最低的α-Gal A糖形式(含最多负电荷)，有限制地合并早期butyl洗脱液将会增强带较多电荷的α-Gal A。将选择的这些合并液应加于肝素层析柱上，并再次有限制的合并较早的、带较多负电荷的α-Gal A种类，更加增强了合并液中低pI的α-Gal A糖形式所占比率。可以在纯化过程的各个步骤中，通过SDS-PAGE和等电聚焦监控洗脱液的大小和电荷分布来进一步精细调整糖形式群的。下文实施例2.4概述了通过大小和电荷的不同进行分离的例子。
用于碳水化合物改造的第二种方法包括使用纯化的糖基转移酶和适当的核苷酸糖供体通过附着额外的末端糖残基来修饰纯化的α-Gal A的某些糖形式。这种处理只影响那些含适当的游离末端糖残基作为所用糖基转移酶的受体的糖形式。例如，α2，6-唾液酰基转移酶以CMP-唾液酸作为核苷酸糖供体在末端Galβ1，4GlcNAc-R受体上以2，6-连接键添加唾液酸。商品化的酶及其来源物种包括墨角藻糖α1，3转移酶III、V、和VI(人)；半乳糖α1，3转移酶(猪)；半乳糖β1，4转移酶(牛)；甘露糖α1，2转移酶(酵母)；唾液酸α2，3转移酶(大鼠)和唾液酸α2，3转移酶(大鼠)。反应完成后，可以通过糖基转移酶特异亲和柱(含有通过焦磷酸(GDP、UDP)或磷酸(CMP)酯键经6碳臂结合凝胶的适当核苷酸)或通过本领域已知的其它层析方法从反应混和物中除去糖基转移酶。在上文所列的糖基转移酶中，唾液酰基转移酶对于酶(诸如α-GalA)的修饰特别有用，可用于人患者的酶取代疗法。使用唾液酰基转移酶与作为核苷酸糖供体的CMP-5-荧光素-神经氨酸产生了荧光标记的糖蛋白，从而可以容易的监控其摄取和组织分布。
用于碳水化合物改造的第三种方法包括α-Gal A生产细胞的糖工程，如导入影响细胞糖基化机制的基因以修改高尔基体中的翻译后加工，是优选的方法。
用于碳水化合物改造的第四种方法包括用适当的糖苷酶处理α-Gal A以降低不同糖形式的存在数目。例如，用神经氨酸苷酶、β-半乳糖苷酶、和β-氨基己糖苷酶相继处理复合聚糖从而将寡糖切至三甘露糖核。
N-连接聚糖的结构取决于蛋白质折叠后聚糖链相对于高尔基体中加工的甘露糖苷酶的可获得性和高尔基体中存在的糖基转移酶家族和适当核苷酸糖供体。许多糖基转移酶催化竞争性反应，导致聚糖链以多种不同且兼容的方式延伸，这取决于是哪种酶首先催化反应。这导致糖形式复杂家族中的微形成和异质性。有些结构对于单个组织是独特的，诸如通过添加GalNAc-4-SO4修饰某些垂体激素，或者将这些结构限制于少数器官。
后者的例子是肾而非肝中谷氨酰转肽酶的复合聚糖上的所谓对分GlcNAc(GlcNAc以β1，4与核心β-甘露糖残基连接)。γ-谷氨酰转肽酶上的对分二岔结构显示如下±Fucα1，6SAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，6\ |GlcNAcβ1，4Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnSAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，3/在哺乳动物中，在脑和肾的某些细胞中以及肝癌患者的肝的某些细胞中发现起作用的酶GlcNAc转移酶III(GnT-III)。GnT-III催化向N-连接糖链的三甘露糖核的β-连接甘露糖以β1，4连接添加N-乙酰氨基葡萄糖，产生对分GlcNAc残基。小鼠、大鼠、和人的GnT-III基因已经得到了克隆(Ihara等人，生化杂志(J.Biochem.)(东京)113692-698，1993)。
人细胞中存在的其它GlcNAc转移酶III活性可以以二岔、三岔、和四岔复合聚糖为代价而生产更多的单磷酸化杂合聚糖。这对血浆中的半衰期不会有不利影响，但是可以加强在血管内皮细胞中的定位。代表性结构显示如下P-Manα1，6\GlcNAcβ1，4Manα1，6\ |Manα1，3/Manβ1，4GlcNAcβ1，4GlcNAc-AsnSAα2，3/6Galβ1，4GlcNAcβ1，2Manα1，3/
有些α-Gal A由肾摄取并导致明显降低了贮积糖脂。因为肾可以用对分GlcNAc残基形成N-聚糖，所以肾上皮细胞能够识别带有该表位特异性特别高的糖蛋白。
升高的GnT-III活性可以通过抑制GnT-II、IV、V、和Galβ1，4-转移酶在底物水平的进一步分支而引起在三甘露糖核的分支中的不平衡。最近，通过过度表达重组GnT-III产生了能够在糖蛋白上产生对分寡糖的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(Sburlati等人，生物技术进展(Biotechnol.Progr.)14189-192，1998)。选择β-干扰素(IFN-β)作为模型和潜在的治疗性分泌型异源蛋白质，来评估GnT-III表达对产物糖基化的影响。带有对分寡糖的IFN-β是GnT-III改造的CHO细胞而非未修饰亲本细胞系产生的。
糖蛋白治疗剂的生产需要针对各个批次间是否一致进行糖基化鉴定。已经将“假定N-聚糖电荷Z”作为简单、有效方式分析蛋白质糖基化的参数。已经多次重复实验验证了Z测定，并证明是高度精确和可靠的(Hermentin等人，糖生物学(Glycobiology)6217-230，1996)。由高效阴离子交换层析(HPAEC)/脉冲电流检测(PAD)获得的N-聚糖曲线能够推导出给定糖蛋白的假设N-聚糖电荷。在HPAEC中，按照其电荷(如唾液酸残基数)可以清楚地分开N-聚糖，得出中性结构以及单、二、三、和四唾液酸化N-聚糖的不同区域。Z的定义是无唾液酸、单唾液酸、二唾液酸、三唾液酸、四唾液酸、和五唾液酸区的各个面积(A)分别乘以相应电荷后的和Z＝A(无唾区)·0+A(单唾区)·1+A(二唾区)·2+A(三唾区)·3+A(四唾区)·4[+A(五唾区)·5]Z＝∑A(i)·(i)其中i在无唾液酸区(无唾区)是0，在单唾液酸区(单唾区)是1，在二唾液酸区(二唾区)是2，在三唾液酸区(三唾区)是3，在四唾液酸区(四唾区)是4，在五唾液酸区(五唾区)是5。
因此，大多数C4-4*结构的糖蛋白Z≌400，大多数C2-2*结构的糖蛋白总计Z≌200，而只具有高甘露糖种类或截短结构的糖蛋白Z≌0。
如Z数目测量所得，本发明的人糖基化α-Gal A制剂所含寡糖电荷超过100，优选超过150，更优选超过170。通过磷酸化来改变血清α-Gal A的半衰期可以改变α-Gal A的磷酸化来影响α-Gal A的循环半衰期和进入细胞的α-Gal A水平。优选地在表达α-Gal A的细胞内进行磷酸化。值得特别关注的是，获得磷酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的过程首先将编码磷酸转移酶的DNA序列导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列来调控内源磷酸转移酶基因的表达；然后在表达α-Gal A和磷酸转移酶的条件下培养α-Gal A生产细胞；最后分离磷酸化程度比不含多核苷酸的细胞产生的α-Gal A更高的α-Gal A制剂。这些磷酸转移酶在本领域是众所周知的。参阅，例如美国专利5,804,413和5,789,247，引入本文中作为参考。
在溶酶体蛋白酶上产生M6P识别标记需要两种膜结合的高尔基体酶的协同作用。第一种，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖糖蛋白N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶(GlcNAc磷酸转移酶)，它需要溶酶体酶上的蛋白质识别决定簇，由相距34、与高甘露糖链具有正确空间关系的两个赖氨酸残基组成。第二种，N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸二酯α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(磷酸二酯α-GlcNAcase)，水解暴露M6P识别位点的α-GlcNAc-磷酸酯键。
按照本发明的方法，由本发明方法生产的α-Gal A制剂具有多种糖形式，其中16-50％的糖形式发生了磷酸化，优选地25-50％，更优选地至少30％。通过增加唾液酸化来改变血清α-Gal A的半衰期增加具有末端半乳糖残基的未脱唾液酸聚糖的唾液酸化可以用唾液酰基转移酶基因转染哺乳动物和优选的人细胞来完成。
本发明提供了如下产生的寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂首先将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控内源唾液酰基转移酶基因表达的调控序列；然后在表达α-Gal A和唾液酰基转移酶的条件下培养α-Gal A生产细胞；随后的步骤包括分离寡糖电荷增加的α-Gal A制剂。优选的唾液酰基转移酶包括α2，3-唾液酰基转移酶和α2，6-唾液酰基转移酶。这些唾液酰基转移酶是众所周知的。例如，参阅美国专利5,858,751，引入本文中作为参考。
在优选的实施方案中，增加唾液酸化的该方法包括通过分离或纯化本制剂来选择大小或电荷增加的α-Gal A糖形式的额外步骤(如下文讨论的)。
或者，本发明提供了通过在低铵环境中维持细胞来加强唾液酸化的方法。特别是，通过将α-Gal A生产细胞接触铵浓度低于10mM(更优选低于2mM)的培养基来获得唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制剂。可以通过灌注生产细胞定期除去培养基中的有害代谢物(诸如氨)来加强唾液酸化。在优选的实施方案中，低铵环境是通过向生产细胞加入谷氨酰胺合成酶基因或cDNA来兑现。或者，用新鲜培养基灌注α-Gal A生产细胞来兑现低铵环境，将铵浓度维持在10mM以下，更优选地低于2mM。或者，可以用新鲜培养基间歇灌注生产细胞。如本发明所用，间歇灌注指在规则的、定期的间隔时间，或在测量铵浓度之后进行灌注，逐渐达到靶浓度(即10mM，更优选地低于2mM)。间歇灌注的频率应当相当，使得铵浓度从不超过靶浓度。灌注生产细胞足够的时间，获得α-Gal A制剂，其中总聚糖的50-70％发生了唾液酸化，优选地60％。通过α-Gal A的PEG化来延长血清α-Gal A的循环半衰期同样按照本发明，可以将α-Gal A与聚乙二醇复合来延长人糖基化α-Gal A制剂的循环半衰期。聚乙二醇(PEG)是水溶性聚合物，当与蛋白质共价连接时，能够改变蛋白质的特性从而扩大它们的潜在用途。聚乙二醇修饰(“PEG化”)是一种已完善建立的技术，能够解决或改善蛋白质或肽制药学的许多问题。
与未修饰形式相比，PEG-蛋白质改进后的药理学表现促成了这种共轭物发展成为治疗剂。使用天然酶治疗无效(由于快速清除和/或免疫学反应)的酶缺陷疾病，现在可以用等同的PEG-酶进行治疗。例如，PEG-腺苷脱氨酶早已获得FDA认证(Delgado等人，治疗性药物载体系统评论(Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.)9249-304，1992)。
PEG与绿色咖啡豆的α-半乳糖苷酶的共价吸附，通过掩盖分子上的特异决定簇位点而改变了酶的催化特性。这导致针对对-硝基酚的Km上升而Vmax下降(Wieder和Davis，应用生化杂志(J.Appl.Biochem.)5337-347，1983)。α-半乳糖苷酶仍然能够从人唾液血型物质B切除末端半乳糖残基。PEG-α-半乳糖苷酶丧失了与抗体和植物凝血素的特异结合。由天然α-半乳糖苷酶产生的抗体能够阻断酶活性，但是当对PEG的量越来越多的酶制剂进行测试时，发现这种抑制逐渐丧失。相反，PEG-α-半乳糖苷酶免疫的动物的抗血清不抑制任何α-半乳糖苷酶或PEG-α-半乳糖苷酶制剂的酶活性。这些结果表明PEG倾向于覆盖特异于植物凝血素的碳水化合物部分和抗原决定簇，而且这些位点在PEG-酶的体内加工过程中可能仍然是未暴露的。
PEG与蛋白质的共价吸附需要激活聚合物的末端羟基，聚合物上的合适离去基团可以用赖氨酸的ε-氨基和N-末端α-氨基的亲核攻击取代。已经开发出激活PEG的多种化学基团。对于每种特定应用，不同的偶联方法具有不同的优点。不同的PEG化方法对获得的PEG化蛋白质和肽的持续的生物学活性、稳定性、和免疫原性等因素具有令人惊讶的和戏剧性的影响(Francis等人，国际血液学杂志(Int.J.Hematol.)68(1)1-18，1998)。例如，无接头PEG化技术只将PEG吸附到靶分子上。更具体的说，如Francis等人(国际血液学杂志(Int.J.Hematol.)68(1)1-18(1998)所述，对多种靶蛋白应用tresyl单甲氧基PEG(TMPEG)的生物学优化PEG化方法，发现了出人意料的保存靶分子生物学活性方面的能力。这和之外不向蛋白质添加PEG以外的其它试剂(显示在用于人治疗中是安全的)的优点使得这种方法对于修饰α-Gal A是理想的。
蛋白质上用于偶联PEG的4个可能的位点是(1)氨基(N-末端和赖氨酸)；(2)羧基(天冬氨酸和谷氨酸)；(3)巯基(半胱氨酸)；和(4)碳水化合物基团(高碘酸盐处理后产生的醛类)。与蛋白质的羧基和碳水化合物的醛基偶联需要含亲核氨基的PEG试剂。PEG结合带负电荷的羧基后，这种化学作用改变了α-Gal A的pI。pI的任何变化可能影响α-Gal A的生物学活性。此外，将PEG与碳水化合物链偶联可能影响M6P受体摄取α-Gal A，这对于生物学活性起决定性的。巯基化学还影响分子的物理结构，因而不推荐。
PEG化的常用方法在蛋白质的氨基与单甲氧基-PEG的甲氧基之间形成酰胺键。NHS-PEG已经商品化，它在蛋白质与PEG之间产生酰胺键。酰胺键的形成由于失去了带正电荷的-NH2基团从而改变了pI。
将PEG与α-Gal A偶联而不影响其pI的方法使用的是tresyl-PEG。tresyl-PEG通过氨基发生偶联并形成稳定的仲胺。仲胺提供了保留氨基正电荷的优势。tresyl-PEG试剂已经商品化，而且作为冻干粉末是稳定的。tresyl-PEG已经彻底鉴定，而且反应和副产物也已经彻底了解。因此，在优选的实施方案中，将α-Gal A制剂与tresyl单甲氧基复合(TMPEG)，形成PEG化的α-Gal A。然后纯化PEG化的α-Gal A得到分离的PEG化α-Gal A。
反应示意图CH3(OCH2CH2)nOSO2CH2CF3+H2N-蛋白质↓CH3(OCH2CH2)n-HN-蛋白质-treylated单甲氧基-PEGα-Gal A含有18个氨基，17个ε-氨基(赖氨酸)和1个α-氨基(N-末端)。可以控制反应以产生含取代极少的α-Gal A，然后可以从未取代或多重取代的形式纯化每分子含1个PEG或每分子的PEG平均数更小的分子。α-Gal A上的多重取代可能对生物学活性没有明显影响；因此终产物可能含有吸附了1-18个PEG分子的异种混和物组成。取代水平将取决于保留的酶活性水平。应当注意的是，降低的酶活性可以通过延长α-Gal A的循环半衰期和降低α-Gal A的免疫识别，增强了治疗效果来弥补。因此，在开发PEG-α-Gal A产品时，PEG与α-Gal A的比率将取决于生物学活性，而不仅是酶活性。
PEG化反应需要控制pH、缓冲液组成、和蛋白质浓度。适当的反应条件可以通过目前用于制造过程的超滤/渗滤步骤来兑现。临反应前，将tresyl-PEG快速溶于水，连续搅动。然后将此溶液加入制备的α-Gal A，并于控制的时间内于控制的温度进行反应(如2小时和250℃)。PEG化可以在最终纯化过程之前进行，这样在纯化过程中就不需要加入步骤。偶联完成后，在纯化过程的剩余步骤中加之PEG-α-Gal A。在Q层析(阴离子交换)之前进行反应允许在两步纯化步骤中除去反应副产物。由于PEG不带负电荷，它不能保留在Q Sepharose上，将洗脱在柱外体积中。
PEG化的量是可以通过已知技术测量的。例如，当荧光胺结合蛋白质的α-氨基和ε-氨基时会发荧光。PEG化后的荧光损失百分率与结合α-Gal A的PEG百分率有关。可以利用Pierce总蛋白质BCA实验测定蛋白质浓度。将羟甲香豆素-α-D-半乳糖吡喃糖苷(4-MUF-α-Gal)活性实验用于评估对PEG-α-Gal A酶活性的作用。α-Gal A包含吸进溶酶体所需要的M6P。可以使用基于细胞的测试，监控细胞中PEG-α-Gal A进入溶酶体来评估PEG对M6P受体识别的干涉。α-Gal A制剂的施用方法本发明的组合物(即包含多种α-Gal A糖形式)可以通过任何与α-Gal A制剂兼容的途径施用。纯化的α-Gal A制剂可以对α-Gal A蛋白质生成不足或缺陷或者受益于α-Gal A治疗个体施用。本发明的治疗性制剂可以通过任何适当的方法直接地(如局部性的地，如通过注射、植入、或局部对组织部位施用)或全身性的(如通过口服或胃肠外)提供给个体。
施用途径可以是口服或胃肠外，包括静脉内、皮下、动脉内、腹膜内、眼、肌肉内、口、直肠、阴道、眼窝内、脑内、真皮内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、池内、囊内、肺内、鼻内、穿粘膜、穿真皮、或吸入。肺内投递的方法、器械、和药物制剂描述于，例如美国专利5,785,049、5,780,019、和5,775,320，引入本文中作为参考。真皮内投递的优选方法是通过贴剂离子电渗投递，美国专利5,843,015教授了这种投递的一个例子，引入本文中作为参考。
特别有用的施用途径是皮下注射。可以把本发明α-Gal A制剂配制成以一次注射1-2ml施用所需总剂量。为了能够进行1-2ml体积的注射，可以把本发明α-Gal A制剂的浓度配制成在1-2ml体积中含有优选剂量，或者将α-Gal A制剂配制成冻干粉形式，在施用前用水或合适的生理学兼容缓冲液再构成配方。α-Gal A制剂的皮下注射具有方便患者的优点，特别是能够自己施用，同时血浆半衰期比例如静脉内施用更长。延长血浆半衰期导致在较长时间内可以维持有效的血浆α-Gal A水平，这样的优点是加大了临床上受影响的组织注射的α-Gal A的接触，结果增加了进入这些组织的α-Gal A。这给患者带来更多有利的影响和/或降低施用频率。此外，正如上面讨论的多种为方便患者设计的装置，诸如可再注注射笔和无针头注射装置可以与本发明α-Gal A制剂一起使用。
可以是定期注射大剂量制剂，或者可以是从外部的(如IV袋)或内部的(如生物学可蚀植入物、生物学人造器官、或植入α-Gal A的生产细胞群)储藏库，在静脉内或腹膜内施用。参阅，例如美国专利4,407,957和5,798,113，引入本文中作为参考。肺内投递的方法和器械在例如美国专利5,654,007、5,780,014、和5,814,607中有叙述，文献引入本文中作为参考。其它有用的胃肠外投递系统包括乙烯-乙烯乙酸酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输液系统、泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针头投递注射、无针头注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和透皮贴。无针头注射装置在美国专利5,879,327、5,520,639、5,846,233、和5,704,911，这些专利的说明书引入作为参考。任何上述α-Gal A制剂都可以用这些方法施用。
途径和蛋白质的投递量可以根据熟练技术人员完全能够评估的因素来决定。此外，熟练技术人员知道对于指定患者，治疗性蛋白质的施用途径和剂量可以改变，直到达到起治疗作用的剂量水平。α-Gal A蛋白质的制药学配方本发明还提供了基本上不含非α-Gal A蛋白质(诸如清蛋白、由宿主细胞产生的非α-Gal A蛋白质、或由动物组织或流体分离的蛋白质)的α-Gal A制剂的新配方。
制剂优选包含部分水性或生理学相容流体悬浮液或溶液。由于载体是生理学相容的，所以除了向患者投递需要的制剂，它对患者的电解质和/或容积平衡没有不良影响。用于胃肠外施用的溶液可以通过制药学领域众所周知的任何方法制备。参阅，如《雷明顿制药科学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，A.Gennaro编，Mack出版社，1990。也可以使用非胃肠外配方，诸如栓剂和口服配方。
优选地，配方含有赋形剂。配方中可能包括的、α-Gal A的制药学可接受的赋形剂是缓冲液，诸如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、和碳酸氢盐缓冲液、氨基酸、尿素、乙醇、抗坏血酸、磷脂；蛋白质，诸如血清清蛋白、胶原蛋白、和明胶；盐，诸如EDTA或EGTA和NaCl；脂质体；聚乙烯吡咯烷；糖，诸如葡聚糖、甘露醇、山梨醇、和甘油；丙二醇和聚乙二醇(如PEG-4000、PEG-6000)；甘油；甘氨酸和其它氨基酸；和脂类。与α-Gal A制剂一起使用的缓冲液系统包括柠檬酸盐；醋酸盐；碳酸氢盐；和磷酸盐缓冲液(都可从Sigma获得)。磷酸盐缓冲液是优选的代表。α-Gal A制剂的优选pH范围是pH4.5-7.4。
配方还优选包含非离子去污剂。优选的非离子去污剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、屈立通X-100、屈立通X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡萄糖苷、辛基β-葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、和吐温20(都可从Sigma获得)。
特别优选的配方含有聚山梨酯20或聚山梨酯80非离子去污剂和磷酸盐缓冲液，最优选地pH6。
对于冻干α-Gal A制剂，蛋白质浓度可以是0.1-10mg/mL。可以在冻干混和物中加入膨胀剂，诸如甘氨酸、甘露醇、清蛋白、和葡聚糖。另外，还可以向冻干混和物中加入可能的冷冻保护剂，诸如二糖、氨基酸、和PEG。还可以加入上文列出的任何缓冲液、赋形剂、和去污剂。
在优选配方中，用于注射的α-Gal A的浓度是1mg/mL。
施用配方可以包括甘油和其它高粘度组分，有助于将试剂保持在期望部位。生物学相容性聚合物，优选生物学可再摄取的、生物学兼容的聚合物(包括如透明质酸、胶原蛋白、聚丁酸酯、丙交酸、和乙交酸聚合物，以及丙交酸/乙交酸共聚物)，可以作为赋形剂控制试剂在体内释放。胃肠外配方可以具有口服施用的甘氨胆酸盐、直肠施用的甲氧水杨酸盐、或阴道的cutric acid。直肠施用的栓剂可以通过混和本发明α-GalA制剂与无刺激性赋形剂(诸如可可脂或在室温是固态而在体温是液态的其它组分)制备。
吸入施用配方可以包括乳糖或其它赋形剂，或者可以是含有聚氧乙烯-9-十二醚、糖胆酸盐、或脱氧胆酸盐的水溶液。优选的吸入气雾剂的特征为具有质量密度小，个大的颗粒。质量密度小于0.4g/cm3且平均直径超过5μm的颗粒能将吸入的治疗剂有效地投递至体循环中。这些颗粒被深深的吸入肺中，并能逃避肺的自然清除机制，直至吸入颗粒递送装载的治疗剂(Edwards等人，科学(Science)2761868-1872，1997)。例如使用美国专利5,654,007、5,780,014、和5,814,607所述的制备和配制方法可以气雾剂形式施用本发明α-Gal A制剂，文献引入本文中作为参考。鼻内施用配方可以包括以鼻滴液形式施用的油性溶液，或者鼻内施用的凝胶。
将α-Gal A制剂分散在皮肤病学可接受载体(诸如洗液、乳膏、油膏、或肥皂)中可以制备皮肤表面局部施用配方。特别有用的载体能够在皮肤上形成薄膜或薄层从而能局部应用并抑制清除。为了局部施用于内部组织表面，可以将α-Gal A制剂散布于液体组织胶合剂或已知能增强组织表面摄取的其它物质中。例如，对于穿粘膜药物投递，已经叙述过多种粘膜胶合剂和口含片剂，诸如美国专利4,740,365、4,764,378、和5,780,045，引入本文中作为参考。其中还可以掺入羟丙纤维素或纤维蛋白原/凝血酶溶液。或者，使用组织覆盖液，诸如含果胶配方。
本发明制剂可以装备在适当的分装和储存过程中适合于保持无菌，保护活性成分的活性、并可方便有效获得对患者施用的试剂的容器中。也可以装备在适于使用针头和注射器取药的封闭药瓶中，以供应α-Gal A制剂的可注射配方。药瓶可以一次性或多次使用。还可用预装注射器供应制剂。在某些情况中，可在液体配方中供应内容物；而在其它情况中，可以干燥或冻干状态供应，在某些情况中，需要用标准的或可供应的稀释剂重构成液体状态。当以静脉内施用液体形式供应制剂时，可以在适合于连接静脉内施用线或导管的无菌袋或容器中提供。在优选的实施方案中，本发明制剂是在便于施用预定剂量的制剂的装置中，以液体或粉末配方供应；这些装置的例子包括用于皮下或肌肉内注射的无针头注射器和计量式气雾投递装置。在其它情况中，本制剂可以适合于持续释放的形式供应，诸如应用于皮肤穿真皮施用的贴剂或敷料，或者用于穿粘膜施用的可蚀装置。在以片剂或丸剂形式口服施用本制剂的情况中，制剂可以在带可摘盖的瓶中供应。容器可以标有说明诸如制剂类型、制造者或分装者姓名、指示、建议剂量、正确储存指示、或施用指示等。α-Gal A制剂的施用剂量本发明还提供了对Fabry病、Fabry病非典型性变异型、或者α-GalA水平降低或存在α-Gal A突变形式的任何病症的患者施用α-Gal A制剂的方法。施用剂量优选地每kg体重0.05-5.0mgα-Gal A制剂，更优选0.1-0.3mg，一周一次或两周一次。在优选的实施方案中，施用剂量约0.2mg/kg，二周一次。在患者的生命期中有必要有规则的重复施用蛋白质剂量。可以利用皮下注射维持较长期的全身性接触药物。皮下剂量可以是每kg体重0.01-10.0mg α-Gal A制剂，优选0.1-5.0mg，一周一次或两周一次。肌肉内注射的α-Gal A制剂剂量可以与皮下注射相同或不同；在优选的实施方案中，肌肉内剂量较小，且施用频率较低。α-Gal A制剂还可以静脉内施用，如静脉内大剂量注射、慢推静脉内注射、或连续静脉内注射。连续IV输液(如2-6小时)能够维持特定的血液中水平。
对患者施用α-Gal A制剂的备选优选方法包括在几年时间(如长达3年)里一周一次或两周一次施用优选剂量的α-Gal A制剂，在此期间对患者进行临床监控以评价其疾病状况。通过例如改善肾或心功能或者患者整体健康(如疼痛)测量的临床进步，和通过例如尿、血浆、或组织CTH水平的下降的实验室测量的进步，评价患者的健康状况。在治疗和监控期间观察到临床进步的情况后，可以降低α-Gal A的施用频率。例如，接受一周一次注射α-Gal A制剂的患者可以改成两周一次注射。或者，接受两周一次注射α-Gal A制剂的患者可以改成一月一次注射。在服药频率改变之后，应当对患者再监控几年，如3年，以评价与Fabry病相关的临床和实验室测量结果。在优选的实施方案中，如果改变服药频率，则不改变施用剂量。这确保了在每次施用剂量后某些药物动力学参数(如最大血浆浓度[Cmax]、达到最大血浆浓度的时间[tmax]、血浆半衰期[t1/2]、和以曲线下面积[AUC]测量的暴露)保持相对恒定。维持这些药物动力学参数将导致服药频率改变时受体介导的α-Gal A摄取进入组织的水平相对恒定。
非典型性变异型Fabry病(如展示主要为心血管异常或肾累及)患者可以用这些相同的剂量方案，即0.05-5mg/kg体重，一周一次或两周一次治疗。剂量可以根据需要调整。例如，使用α-半乳糖苷酶A酶取代疗法治疗的心变异型表型患者在治疗后心脏组成将变化心功能将得到改善。这种变化可以用检测Fabry病患者左心室壁厚度增加的标准回声心动图测量(Goldman等人，J Am Coll Cardiol 71157-1161，1986)。在治疗过程中可以进行左心室壁厚度的一系列回声心动图测量，而心室壁大小的减小表明对治疗有应答。接受α-Gal A酶取代疗法的患者还可以用心核磁成像(MRI)进行追踪。MRI能够评价指定组织的相对组成。例如，心MRI表明，相对于对照患者，Fabry病患者在心肌膜内沉积脂类(Matsui等人，美国心脏杂志(Am Heart J) 117472-474，1989)。对接受酶取代疗法的患者的一系列心MRI评价表明患者心脏中脂类沉积有变化。肾变异型表型患者也能受益于α-半乳糖苷酶A酶取代疗法。治疗效果可以通过肾功能标准测试来测量，诸如24小时尿蛋白水平、肌酸酐水平、和肾小球过滤速率。下列实施例是为了更全面地例示本发明的优选实施方案而提供的。决不应当认为这些实施例是所附权利要求确定的本发明范围的限制。
实施例实施例1.设计用于投递并表达α-Gal A的构建物的制备与用途构建了两种表达质粒，pXAG-16和pXAG-28。这些质粒含有编码α-GalA酶398个氨基酸(不含α-Gal A信号肽)的人α-Gal A cDNA、由人生长激素(hGH)基因第一个内含子中断的hGH信号肽基因组DNA序列、和含多聚腺苷酸化信号的hGH基因3’非翻译序列(UTS)。质粒pXAG-16含有人细胞肥大病毒立即早期(CMV IE)启动子和第一个内含子(侧翼为非编码外显子序列)，而质粒pXAG-28由胶原蛋白Iα2启动子和外显子1驱动，它还包含β-肌动蛋白基因的5’UTS(含β-肌动蛋白基因的第一个内含子)。
1.1克隆完整的α-Gal A cDNA和构建α-Gal A表达质粒pXAG-16从人成纤维细胞cDNA文库克隆人α-Gal cDNA是如下构建的。mRNA是从总RNA分离的，cNDA的合成是使用λZapII系统的试剂按照制造商(Stratagen公司，La Jolla，CA)的说明进行。简而言之，cDNA的“第一条链”是存在含内部XhoI限制性内切酶位点的寡聚dT引物时，通过逆转录产生的。继RNA酶H处理之后，用DNA聚合酶I对cDNA进行缺刻翻译产生双链cDNA。用T4 DNA聚合酶将此cDNA末端补平，并连接EcoRI衔接头。将连接产物用T4 DNA激酶进行处理并用XhoI进行消化。通过Sephacryl-400层析分离cDNA。合并大的和中等大小的收集液，并将cDNA与EcoRI和XhoI已消化的λZapII臂连接。然后对此连接产物进行包装并滴定。初级文库的滴度为1.2×107pfu/mL，平均插入片段大小为925bp。
来自人α-Gal A基因外显子7的210bp探针(
图1，SEQ ID NO1)已经被用于分离cDNA。探针自身是通过聚合酶链反应(PCR)使用下列寡核苷酸5’-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3’(寡聚物1；SEQ ID NO6)和5’-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3’(寡聚物2；SEQ ID NO7)从基因组DNA分离得到的。然后将PCR产物用于筛选成纤维细胞cDNA文库，分离阳性克隆并进一步鉴定。将一个阳性克隆，噬菌体3A，根据制造商的说明进行λZapII系统切除方案(Stratagene公司，La Jolla，CA)。在这一步骤产生质粒pBSAG3A，该质粒在pBluescriptSK-TM质粒主链中含有α-Gal A cDNA序列。DNA测序发现此质粒不包含cDNA序列的完整5’端。因此，5’端是使用由人基因组DNA扩增的PCR片段再构成的。为此，使用了下列寡核苷酸5’-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3’(寡聚物3；SEQ ID NO8)和5’-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3’(寡聚物4；SEQ ID NO9)扩增了268bp基因组DNA片段(图2，SEQ ID NO2)。将此片段亚克隆到“TA”克隆质粒(Invitrogen公司，San Diego，CA)中，产生质粒pTAAGEI。用SacII和NcoI消化含大半α-Gal A cDNA序列的质粒pBSAG3A和含α-Gal A cDNA 5’端的质粒pTAAGEI。图2表示了相关的SacII和NcoI位点在扩增的DNA片段中的位置。从pTAAGEI分离0.2kb的SacII-NcoI片段，与同样消化的pBSAG3A连接。这一质粒，pAGAL含有完整的α-Gal AcDNA序列，含有编码α-Gal A信号肽的序列。将它的cDNA完整测序(表示于图3，包括α-Gal A信号肽；SEQ ID NO3)发现与人α-Gal A cDNA的发表序列相同(Genbank序列HUMGALA)。
如下，经多种中间物构建了质粒pXAG-16。首先，用SacII和XhoI消化pAGAL并补平末端。然后，将完整的α-Gal A cDNA的末端与XbaI接头连接并亚克隆到经XbaI消化的pEF-BOS(Mizushima等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)185322，1990)中产生pXAG-1。此构建物在编码α-Gal A和α-Gal A信号肽的cDNA侧翼具有人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)3’UTS和人延伸因子-1a(EF-1a)启动子，使α-Gal A cDNA的5’端与EF-1a启动子融合。为了制成带有CMV IE启动子及第一个内含子的构建物，从pXAG-1切下为2kb XbaI-BamHI片段的α-Gal A cDNA和G-CSF 3’UTS。将片段补平末端，连接BamHI接头，并插入BamHI已消化的pCMVflpNeo(如下所述构建)。取向是将α-Gal A cDNA的5’端与CMV IE启动子区融合。
pMVflpNeo是如下产生的。通过PCR使用CMV基因组DNA作为模板和下列寡核苷酸5’-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3’(SEQ IDNO10)和5’-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3’(SEQ ID NO11)扩增CMV IE基因启动子片段。用BamHI消化获得的产物(1.6kb片段)，产生具有BamHI粘性末端的含CMV启动子的片段。以1.1kb XhoI-BamHI片段从质粒pMClneopA(Stratagene公司，La Jolla，CA)分离neo表达单位。将含CMV启动子和neo的片段插入经BamHI和XhoI消化的质粒(pUC12)。值得注意的是，pCMVflpNeo包含，从第546位核苷酸开始至第2105位核苷酸结束(Genbank序列HS5MIEP)的CMV IE启动子区，以及由5’端紧随CMV IE启动子片段的单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子(Tkneo基因)驱动的新霉素抗性基因。neo基因的转录方向与CMV启动子片段相同。此中间构建物称为pXAG-4。
为了加入hGH 3’UTS，以XbaI-SmaI片段从pXAG-4切除GCSF 3’UTS，并补平pXAG-4的末端。从pXGH5(Selden等人，分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biology)63173-3179，1986)以0.6kb SmaI-EcoRI片段切下hGH 3’UTS。将此片段补平末端后，连接到pXAG-4中，紧随pXAG-4中补平末端的XbaI位点之后。此中间物称为pXAG-7。由此质粒以HindIII-ClaI片段切除TKneo片段，并用DNA聚合酶I的Klenow片段通过“填补”补平质粒末端。SV40早期启动子驱动的新霉素抗性基因作为来自pcDNeo(Chen等人，分子和细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)72745-2752，1987)的ClaI-BsmBI补平片段接入质粒，neo转录单位的取向与α-Gal A转录单位相同。此中间物称为pXAG-13。
为了完成含26个氨基酸hGH信号肽编码序列和hGH基因第一个内含子的pXAG-16，首先切下pXAG-13的2.0kb EcoRI-BamHI片段。此片段包含α-Gal A cDNA和hGH 3’UTS。用3个片段取代此大片段。第一个片段是0.3kb的pXGH5 PCR产物，从恰好位于Kozak保守序列上游的合成BamHI位点至hGH信号肽编码序列终点，它含hGH信号肽编码序列和hGH第一个内含子序列。此片段(片段1)是利用下列寡核苷酸5’-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3’(寡聚物HGH101；SEQ ID NO12)和5’-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3’(寡聚物HGH102；SEQ ID NO13)扩增的。第二种片段是0.27kb PCR产物，所含序列对应于编码398个氨基酸α-Gal A酶(即缺α-Gal A信号肽)的cDNA起点至NheI位点。此片段(片段2)是利用下列寡核苷酸5’-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3’(寡聚物AG10；SEQ ID NO14)和5’-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3’(寡聚物AG11；SEQ ID NO15)扩增的。第三种片段即pXAG-7的NheI-EcoRI片段(片段3)，含剩余α-Gal A序列以及hGH 3’UTS。
将片段1(用BamHI和NaeI消化)、片段2(用PvuII和NheI消化)、和片段3与含neo基因和CMV IE启动子的pXAG-13的6.5kb BamHI-EcoRI片段混和，并连接到一起产生pXAG-16(图4)。
1.2构建α-Gal A表达质粒pXAG-28如下分离用于α-Gal A表达构建物pXAG-28的人胶原蛋白Iα2启动子。使用下列寡核苷酸分离含部分人胶原蛋白Iα2启动子的人基因组DNA的408bp PCR片段5’-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3’(寡聚物72；SEQ ID NO16)和5’-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3’(寡聚物73；SEQ ID NO17)。
将次片段用于筛选EMBL3中的人白细胞文库(Clontech公司，PaloAlto，CA)。分离含3.8kb EcoRI片段的一个阳性克隆(噬菌体7H)，并克隆到pBSIISK+(Stratagene公司，La Jolla，CA)的EcoRI位点产生pBS/7H.2。用SpeI(切割pBSIISK+多接头)消化、用DNA聚合酶I的Klenow片段“填补”、并插入寡核苷酸5’-CTAGTCCTAGGA-3’(SEQ ID NO18)，由此向pBSIISK+中导入了AvrII位点。用BamHI和AvrII消化此pBSIISK+变体，并与上述最初的408bp胶原蛋白Iα2启动子PCR片段的121bp BamHI-AvrII片段连接，产生pBS/121COL.6。
用XbaI(切割PBSIISK+多接头序列)消化质粒pBS/121COL.6，用DNA聚合酶I的Klenow片段“填补”，并用AvrII消化。分离pBS/7H.2的3.8kb BamHI-AvrII片段，并用Klenow酶补平BamHI位点。然后用AvrII消化片段，并连接经AvrII消化的载体，由此产生胶原蛋白启动子质粒pBS/121bpCOL7H.18。
然后融合胶原蛋白启动子与含人β-肌动蛋白基因第一个内含子的人β-肌动蛋白基因。为了分离此序列，使用下列寡核苷酸5’-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3’(寡聚物BA1；SEQ ID NO19)和5’-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3’(寡聚物BA2；SEQ ID NO20)从人基因组DNA分离2kb的PCR片段。
用BamHI和BsiHKAI消化此片段，释放含β-肌动蛋白5’UTS和内含子的0.8kb片段。然后从胶原蛋白启动子质粒pBS/121bpCOL7H.18如下分离3.6kb SalI-SrfI片段。用BamHI(BamHI位点位于胶原蛋白Iα2启动子片段5’端)部分地消化pBS/121bpCOL7H.18，用Klenow片段补平末端，并连接SalI接头(5’-GGTCGACC-3’)，将SalI位点放置于胶原蛋白Iα2启动子上游。然后用SalI和SrfI(SrfI位点位于胶原蛋白Iα2启动子CAP位点上游110bp)消化此质粒，并分离3.6kb片段。将0.8kb片段和3.6kb片段与经SalI和BamHI消化的pBSIISK-(Stratagene公司，La Jolla，CA)和退火下列四种寡核苷酸5’-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCGTAT-3’(寡聚物COL-1；SEQ ID NO21)，5’-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3’(寡聚物COL-2；SEQ ID NO22)，5’-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3’(寡聚物COL-3；SEQ ID NO23)，和5’-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3’(寡聚物COL-4；SEQ ID NO24)组成的片段(所形成的片段含一个平末端和一个BsiHKAI末端)结合在一起。
当退火时，这四种寡核苷酸对应于由胶原蛋白启动子SrfI位点开始并延续经过β-肌动蛋白启动子BsiHKAI位点的区域。获得的质粒命名为pCOL/β-肌动蛋白。
为了完成pXAG-28的构建，从pCOL/β-肌动蛋白分离了含胶原蛋白Iα2启动子和β-肌动蛋白5’UTS的SalI-BamHI片段。将此片段连接来自pXAG-16的两个片段(见实施例1.1和图4)(1)6.0kb BamHI片段(含neo基因、质粒主链、编码398个氨基酸α-Gal A酶的cDNA、和hGH 3’UTS)；和(2)0.3kb BamHI-XhoI片段(含来自pcDneo的SV40 polyA序列)。pXAG-28包含融合在一起的人胶原蛋白Iα2启动子、β-肌动蛋白5’UTS、hGH信号肽(由hGH第一个内含子中断)、编码α-Gal A酶的cDNA、和hGH 3’UTS。完整表达构建物pXAG-28的图谱表示在图5。
1.3用α-Gal A表达质粒电穿孔转染和选择成纤维细胞为了在成纤维细胞中表达α-Gal A，按照公开的方法(Selden等人，WO93/09222)培养并转染次生成纤维细胞。
通过电穿孔将质粒pXAG-13、pXAG-16、和pXAG-28转染到人包皮成纤维细胞中，产生转染稳定的无性繁殖细胞株，并如实施例1.4所述监控得到的α-Gal A的表达水平。正常包皮成纤维细胞分泌的α-Gal A水平范围为2-10单位/106细胞/24小时。相反的，经转染成纤维细胞展示的平均表达水平如表2所示。
表2.α-Gal A平均表达水平(±标准偏差)pXAG-13 420±344U/106细胞/天N＝26个无性株(范围3-1133U/106细胞/天)pXAG-16 2051±1253U/106细胞/天N＝24个无性株(范围422-5200U/106细胞/天)pXAG-28 141±131U/106细胞/天N＝38个无性株(范围20-616U/106细胞/天)这些数据显示，所有三种表达构建物能够使α-Gal A的表达比未转染成纤维细胞增加许多倍。用编码连接α-Gal A信号肽的α-Gal A的pXAG-13稳定转染的成纤维细胞的表达实质性地比用pXAG-16转染的成纤维细胞低；pXAG-16的不同在于信号肽是hGH信号肽，它的编码序列由hGH基因的第一个内含子中断。
在每次进行传染细胞的传代时，都要测定分泌的α-Gal A活性，进行细胞计数，并计算细胞密度。根据收获的细胞数目和α-Gal A的分泌时间，测定α-Gal A的特异表达速率，并将α-Gal A分泌单位/106细胞/24小时表示于表3和表4。基因治疗或生产α-Gal A的纯化材料所需要的细胞株应当在多次传代中展示生长和表达出稳定。表3和表4表示了用α-Gal A表达构建物pXAG-16稳定转染的细胞株的数据，举证了α-GalA表达在多次传代中保持稳定的事实。
表3.含α-Gal A表达构建物pXAG-16的BRS-11细胞的生长和表达传代 表达 细胞密度(单位/106细胞/24小时) (细胞/cm2)13 26014.80×10414 16164.40×10415 35954.40×104表4.含α-Gal A表达构建物pXAG-16的HF503-242细胞的生长和表达传代 表达 细胞密度(单位/106细胞/24小时) (细胞/cm2)5 40692.80×1046 75853.55×1047 50342.48×1041.4α-Gal A表达的量化使用水溶性底物4-羟甲香豆素-α-D-半乳糖吡喃糖苷(4-MUF-gal；Research Product公司)，根据Ioannou等人(细胞生物学杂志(J.CellBiol.)119.1137-1150，1992)所述修改方案，测量α-Gal A活性。将底物溶于底物缓冲液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐，pH4.6)至浓度1.69mg/mL(5mM)。通常，向75mL底物溶液中加入10mL培养物上清液。将管盖上并在37℃水浴中温育60分钟。在温育期结束时，加入2mL甘氨酸-碳酸盐缓冲液(130mM甘氨酸，83mM碳酸钠，pH10.6)终止反应。使用具有固定激发波长365nm的TK0100型荧光计(Hoefer ScientificInstruments)检测固定发射波长460nm，测量每份样品的相对荧光。将样品的读数与从1mM羟甲香豆素原液(Sigma Chemical公司)制备的标准液的读数进行比较，并计算水解底物的量。α-Gal A活性的单位表达为；1单位的α-Gal A活性相当于于37℃每小时水解1nmol底物。细胞表达数据通常表示为分泌的α-Gal A活性单位/106细胞/24小时。如下文所讨论的，此实验还用于测量细胞裂解物中和各个α-Gal纯化步骤的样品中的α-Gal A活性的量。
1.5基因激活的α-Gal A(GA-GAL)的制备使用基本上如美国专利5,733,761(引入本文中作为参考)所述的GA技术，通过在人α-Gal A编码序列上游插入调控和结构DNA序列，产生基因激活的α-Gal A(GA-GAL)。基因激活序列的精确插入是转染的DNA片断上的DNA与人细胞中α-Gal A基因座上游的基因组DNA序列之间的同源重组的结果。基因激活序列自身具有α-Gal A编码序列，直至(但不包含)信号肽切割位点。分离含激活的α-Gal A基因座的细胞，并进行药物选择以分离GA-GAL的生成增加的细胞。
通过电穿孔将含适当基因激活序列的靶DNA片段导入宿主人细胞系。一个这样的细胞系是HT-1080，可以从ATCC(Rockville，Maryland)获得的经验证细胞系。图9显示了含这样的DNA片段的基因激活质粒(靶构建物)pGA213C。此质粒包含设计用于激活宿主细胞系中内源α-Gal A基因座部分的序列，还包含编码信号肽而非人α-Gal A的序列。靶构建物还包含细菌neo和小鼠dhfr基因的表达盒。这些基因可用于通过neo基因选择稳定整合的靶片段，并随后可用于氨甲蝶呤(MTX)逐步选择dhfr基因。
另外，pGA213C包含设计用于通过同源重组靶向内源α-Gal A基因座上游染色体序列的序列。内源α-Gal A基因座与pGA213C 9.6kb DNA片段之间的同源重组表示在
图10。
通过pGA213C片段与X-染色体α-Gal A基因座之间的同源重组，构建pGA213C，删除第-1183位至第-222位(相对于α-Gal A的甲硫氨酸起始密码子)的962bp基因座序列。通过精确空位α-Gal A编码区上游的外源调控序列的，进行α-Gal A基因座的转录激活。获得的GA-GAL基因座引起的转录是从CMV启动子起始，经过CMV外显子1、醛缩酶内含子、和α-Gal A编码序列的7个外显子和6个内含子。大型前体mRNA的剪接连接了外源CMV外显子(通过靶向插入)与完整内源α-Gal A转录本的第一个外显子。GA-GAL mRNA的翻译产生含31个氨基酸信号肽的前GA-GAL。紧随宿主细胞的分泌，切除了信号肽。首先通过筛选GA-GAL mRNA的存在的聚合酶链反应鉴定了正确靶向的细胞系。还发现产生GA-GALmRNA的克隆向培养基中分泌有酶活性的α-Gal A。随后通过基因座DNA的限制性酶消化和Southern印渍杂交分析确认了靶向事件。
将细胞进行逐步氨甲蝶呤(MTX)选择。在0.05μM MTX中选择之后，分离一个细胞无性繁殖，并进行0.1μM MTX选择。由此过程分离对0.1μMMTX有抗性的细胞集合，通过培养而扩增，并进行鉴定。实施例2.α-Gal A纯化下文是用于生产、纯化、并测试α-Gal A的优选方法。在纯化过程中，以可溶性的、有活性的、天然的形式保持α-Gal A。在纯化过程中，不将蛋白质与极端pH、有机溶剂、或去污剂接触，不进行蛋白水解切割，且不形成聚集物。设计的纯化过程不改变α-Gal A糖形式的分布。
2.1α-Gal A的纯化实施例2.1例示了α-Gal A可以从培养已经稳定转染产生本酶的人细胞株条件的培养基纯化至几乎同质性。从含α-Gal A的培养基，利用一系列(五步)层析步骤分离α-Gal A。这五步利用各种分离原理，利用酶的不同物理特性将α-Gal A与污染材料分开。包括丁基Sepharose上的疏水相互作用层析、羟基磷灰石上的离子相互作用层析、QSepharose上的阴离子交换层析、和Superdex200上的大小排阻层析。大小排阻层析除了作为纯化过程的最后步骤，还可作为将纯化的蛋白质交换至可兼容配方的缓冲液中的有效方法。
A.使用Butyl Sepharose层析作为α-Gal A纯化中的第一步通过离心使冷的条件培养基(1.34升)澄清，并滤过0.45μm醋酸纤维素滤器(使用玻璃纤维预过滤器)。一边搅拌，一边向冷的、过滤后的培养基中逐滴加入1N HCl，将pH调至5.6。并逐滴加入3.9M超纯硫酸铵原液(室温)至终浓度0.66M。如上所述，于4℃将培养基再搅拌5分钟并进行过滤，然后加于用10mM MES-Tris(pH5.6，含0.66M硫酸铵)(缓冲液A)平衡的Butyl Sepharose4 Fast Flow层析柱上(柱床体积81ml，2.5×16.5cm；Pharmacia，Uppsala，Sweden)。于4℃，在装备了分别用于评估总蛋白质和盐浓度的串联式UV(280nm)和电导率监视器的Gradi-FracTM系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上进行层析。以10ml/min流速加样后，用10倍柱床体积的缓冲液A清洗。用14倍柱床体积的缓冲液A至10mM MES-Tris(pH5.6，不含硫酸铵)线性梯度缓冲液从Butyl Sepharose层析柱洗脱α-Gal A。通过4-MUF-gal实验测定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明显酶活性的收集液。如图8和纯化概述(表5)所示，这一步骤除去了大约99％的污染蛋白质(层析前样品＝8.14g总蛋白质；层析后样品＝0.0638g总蛋白质)。
表5.由稳定转染的人成纤维细胞的条件培养基纯化α-Gal A纯化步骤体积 α-Gal A总蛋 比活性 纯化 回收(ml)活性 白质 (×106单位 倍数 百分(×106单位) (/mg) /mg) (累积) 率培养液上清液134014.6 8140 0.0018 ＝1＝100丁基Sepharose 417 14.1 63.8 0.221 12396.6肝素Sepharose 134 12.1 14.6 0.829 43682.9羟基磷灰石 47 9.73 4.46 2.18 1220 66.6Q Sepharose 31.58.91 3.31 2.69 1503 61.0Superdex200 10 8.58 2.93 2.92 1634 59.0B.使用肝素Sepharose层析作为α-Gal A纯化中的一步将丁基Sepharose层析峰收集液于4℃，对4升10mM MES-Tris(pH5.6，换一次)进行透析。于4℃，根据需要加入H2O或NaGl将透析液电导率调至1.0mMHO。然后，将样品加于用10mM MES-Tris(pH5.6，含9M NaCl)(缓冲液B)平衡的肝素Sepharose6 Fast Flow层析柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床体积29ml，2.5×6cm)上。于4℃，以10ml/min流速进行层析。用串联式UV(280nm)和电导率监视器测量了总蛋白质和盐浓度。加样后，用10倍柱床体积的缓冲液B、3倍柱床体积的至8％缓冲液C/92％缓冲液B(缓冲液C是10mM MES-Tris，pH5.6，含250mM NaCl)的线性梯度缓冲液、和10倍柱床体积的8％缓冲液C清洗层析柱。随后用1.5倍柱床体积的至29％缓冲液C的线性梯度缓冲液及10倍柱床体积的至35％缓冲液C的线性梯度缓冲液洗脱α-Gal A。测定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明显活性的收集液。
C.使用羟基磷灰石层析作为α-Gal A纯化中的步骤将肝素收集液进行过滤，并直接加于用1mM磷酸钠(pH6.0)(缓冲液D)平衡的陶瓷羟基磷灰石HC层析柱(40μm；美国国际化学公司，Natick，MA；柱床体积12ml，1.5×6.8cm)上。于室温，在装备了串联式UV(280nm)和电导率监视器的杂化物Gradi-FracTMFPLC系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上进行层析。以5ml/min流速加样后，用10倍柱床体积的缓冲液D清洗层析柱。用7倍柱床体积的至42％缓冲液E/58％缓冲液D的缓冲液线性梯度及10倍柱床体积的至52％缓冲液E的梯度缓冲液洗脱α-Gal A(缓冲液E是250mM磷酸钠，pH6.0)。测定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明显活性的收集液。
D.使用Q Sepharose阴离子交换层析作为α-Gal A纯化中的步骤于室温，将羟基磷灰石收集液用H2O稀释大约1.5倍至终电导率为3.4-3.6mMHO。过滤后，将样品加于用10％缓冲液G/90％缓冲液F平衡的QSepharoseHP层析柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床体积5.1ml，1.5×2.9cm)。缓冲液F是25M磷酸钠(pH6.0)；缓冲液G是25mM磷酸钠(pH6.0)和250mM NaCl。于室温，在Gradi-FracTM/FPLC杂化物系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上进行层析，并通过串联式计数器监控总蛋白质和盐浓度。以5ml/min流速加样，然后进行下列步骤(1)用5倍柱床体积的10％缓冲液G清洗，(2)用7倍柱床体积的12％缓冲液G清洗，(3)用3倍柱床体积的至50％缓冲液G的线性梯度缓冲液洗脱，(4)用10倍柱床体积的至53％缓冲液G的线性梯度缓冲液洗脱，(5)用3倍柱床体积的至100％缓冲液G的梯度缓冲液洗脱，和(6)用10倍柱床体积的100％缓冲液G清洗。α-Gal A主要在第3步和第4步洗脱。合并含有明显活性的收集液(“Q集合”)。
E.使用Superdex-200凝胶过滤层析作为α-Gal A纯化中的步骤使用Centriprep-10离心浓缩器单位(Amicon，Beverly，MA)将Q集合浓缩约5倍，并加于用25mM磷酸钠(pH6.0，含150mM NaCl)平衡并洗脱的Superdex200层析柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床体积189ml，1.6×94cm)。在FPLC系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上于室温进行层析，用串联式UV监视器(280nm)追踪蛋白质的洗脱。加于层析柱的加样体积≤2ml，流速0.5ml/min，收集液大小2ml。进行多次层析；测定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明显活性的收集液。
使用Centriprep-10单位浓缩来自Superdex-200层析柱的合并收集液，分装，快速冷冻，并短期保存于-80℃。表5表示了对此α-Gal A纯化实施例的概述。α-Gal A的终产量是59％的起始材料活性，纯化产物的比活性是2.92×106单位/mg蛋白质。在还原条件下在4-15％SDS-PAGE上电泳及银染之后，获得的产物表现出高水平的纯度。
小结纯化过程提供了高度纯化的α-Gal A。纯化主要发生于此过程的前2步，而后3步是通过除去剩余的少量污染来提纯材料。最后一步，Superdex200上的大小排阻层析，同时将α-Gal A交换至与可兼容配方的缓冲液中。
2.2培养中的已稳定转染的人细胞产生的α-Gal A的大小研究了纯化的α-Gal A的结构和功能特性。在还原条件下在4-15％SDS-PAGE上电泳及银染之后，获得的产物表现出高水平的纯度。
通过MALDI-TOF质谱法估计α-Gal A的分子量。这些结果证明二聚体的分子量是102,353Da，而单体的分子量是51,002Da。根据氨基酸组成，单体的期望分子量是45,400Da。因此，酶中碳水化合物含量达到5,600Da的分子重量。
2.3由稳定转染人细胞产生的α-Gal A的碳水化合物修饰同时评价了按照本发明生产的α-Gal A的糖基化模式。正确糖基化对于优化α-Gal A的体内活性是重要的；在非糖基化系统中表达的α-GalA无活性或不稳定。Hantzopolous等人，基因(Gene) 57159，(1987)。糖基化对于α-Gal A内在化至期望的靶细胞中也是重要的，糖基化同时还影响酶的体内循环半衰期。在α-Gal A的每个亚基上有4个位点可添加天冬酰胺连接的碳水化合物链，其中只占据了3个位点(Desnick等人，在《遗传性疾病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Basesof Inherited Disease)中，McGraw Hill，纽约，1995，第2741-2780页。
用从A.urafaciens(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)分离的神经氨酸苷酶处理稳定转染细胞产生的α-Gal A样品可以除去唾液酸。将5mg α-Gal A与10mU神经氨酸苷酶在总体积10mL的醋酸缓冲盐(ABS，20mM醋酸钠(pH5.2)和150mM NaCl)中于室温反应过夜。
在ABS(用Tris将pH调升至7.5)中用15U碱性磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶，Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)处理5mg α-Gal A于室温过夜，将由稳定转染细胞产生的纯化α-Gal A去磷酸化。
通过SDS-PAGE和/或等电聚焦及使用抗α-Gal A特异抗体的Western印渍分析样品。所用抗体是利用代表α-Gal A第68-81位氨基酸的肽作为免疫原产生的兔多克隆抗肽抗体。将蛋白质转移至PVDF(Millipore，Bedford，MA)后，用在2.5％blotto(溶于20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.05％吐温20中的脱脂奶粉)中稀释1∶2000的抗血清对膜进行探查。随后用与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(Organo Technique/Cappella，Durham，NC；1∶5000稀释)和ECL化学发光试剂盒(Amersham，ArlingtonHeights，IN)的试剂进行检测。
用神经氨酸苷酶处理α-Gal A，随后进行SDS-PAGE分析，显示了分子量漂移(大约1500-2000Da或4-6个唾液酸/单体)，表明α-Gal A存在广泛的唾液酸修饰。作为参考，α-Gal A的血浆形式具有5-6个唾液酸残基/单体，而胎盘形式具有0.5-1.0个唾液酸残基/单体。Bishop等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2561307，(1981)。
用于检验α-Gal A的唾液酸和M6P修饰的另一种方法是等电聚焦(IEF)，即根据等电点(pI)或净电荷分离样品。由此，可以期望从α-Gal A中除去带电荷的残基(诸如唾液酸或磷酸)来改变蛋白质在IEF系统中的迁移率。
为了进行IEF实验，用神经氨酸苷酶和/或碱性磷酸酶处理按照本发明生产的α-Gal A样品，与2x Novex加样缓冲液(含8M尿素，pH3.0-7.0)1∶1混和，加载于用Pharmalyte(Pharmacia，Uppsala，Sweden；pH3.0-6.5；Pharmalyte4-6.5和2.5-5.5，0.25mL/凝胶)制作的6M尿素IEF凝胶(5.5％聚丙烯酰胺)。还加载了等电点标准(Bio-Rad)。电泳后，如上所述，将凝胶转移至PVDF，并进行Western印渍分析。
用神经氨酸苷酶处理酶增加了所有这3种同工型的pI，表明所有同工型都被唾液酸修饰至一定程度了。这些数据说明如本发明所述生产的α-Gal A制剂将具有需要的血浆半衰期，表明该物质能很好地适用于制药学上的用途。此外，用碱性磷酸酶处理经神经氨酸苷酶处理的α-Gal A将一部分蛋白质的pI进一步增加至大约5.0-5.1，表明酶携带一个或多个M6P残基。这种修饰是靶细胞将α-Gal A有效内在化所需要的。
α-Gal A的N-连接碳水化合物链是通过离子交换HPLC(Glyco-SepC)并用荧光化合物2-氨基苯甲酰胺(AB)标记非还原性末端来分析的。表6概述了来自3种独立的α-Gal A制剂的AB-聚糖的分析结果。所有3种制剂的Z数目都大于170。此外，超过67％的聚糖发生了唾液酸化，超过16％的聚糖发生了磷酸化，而不足16％的聚糖是中性的。与以前报导的结果相比，这些结果非常有利。例如，据Desnick等人(美国专利5,356,804)报导，超过60％的聚糖是中性的，只有11％的聚糖发生了唾液酸化。
表6.来自GA-GAL的AB-聚糖的分析结果处理 Z数目 ％中性％单％二％三 ％四170.04 16.83 22.839.45 15.34 5.58无177.71 14.22 20.63 44.62 14.2 6.31171.68 15.81 20.73 43.214.33 5.39平均值(N＝3) 173.14 15.62 21.39 42.42 14.62 5.76神经氨酸苷酶 24.36 85.25 5.149.61检测不到 检测不到碱性磷酸酶150.93 23.38 24.47 34.28 13.58 4.29本发明的 Desnick等人，占总数的百分率 GA-GAL制剂 美国专利5,356,804总P-聚糖 16.6224.1总唾液酸化 67.5711总中性(hih-甘露糖和杂化物) 15.6262.9表7提供了更详细的纯化GA-GAL制剂的鉴定。
表7.GA-GAL的纯化批量实验40-173-KH42-202-KH比活性 2.75 2.80SDS-PAGE 考马斯 100％100％SDS-PAGE 银染 99.6％ 100％反相HPLC100％99.94％大小排阻层析0％ 0.01％包皮成纤维细胞的内在化 123.6％ 94.3％2.4通过分离α-Gal A种类来增加带电荷的α-Gal A的比率如上所述，可以在此处所述纯化过程中的多个步骤进行α-Gal A糖形式的分级分离。在此实施例中，根据大小和电荷分级分离α-Gal A糖形式。还可能通过上述这些或其它层析技术的组合来分部分离α-Gal A。
对于α-Gal A糖形式的大小分部分离，可以在用磷酸盐缓冲液(pH6)平衡的Superdex200层析柱(Pharmacia，1.6×94.1cm)上进行大小排阻层析。将α-Gal A(1mL中含2.6mg)加于层析柱上，并以0.35mL/min洗脱。收集洗脱过程中的洗脱液，并通过SDS-PAGE分析包含宽广的α-GalA洗脱峰的收集液，然后通过银染可视化。位于峰前沿的收集液含有最大分子量的α-Gal A，随着收集液经过峰，α-Gal A的表观分子量逐渐下降。然后选择和合并α-Gal A收集液，以提供期望分子量范围的α-Gal A制剂。
在根据电荷分部分离α-Gal A的糖形式中，通过Q-Sepharose层析分离α-Gal A。Q-Sepharose层析柱(1.5×9.4cm)用含30mM NaCl的20mM磷酸钠(pH6.0)平衡，并将流速维持在5mL/min。将α-Gal A(166mL中含130mg)加于层析柱上，用平衡缓冲液清洗，然后用含130mMNaCl的20mM磷酸钠(pH6.0)洗脱。对于更广泛的分离，可以使用平衡缓冲液-洗脱缓冲液的梯度缓冲液洗脱(如10倍柱床体积)。收集洗脱过程中的洗脱液，并通过SDS-PAGE分析包含α-Gal A洗脱峰的收集液，然后通过银染观察。在凝胶上观察到的最小分子量种类在清洗中和峰前沿处洗脱，最大分子量的糖形式的洗脱直至峰的结束。较小分子量的种类对应于带较少负电荷的α-Gal A糖形式，与带正电荷的Q-Sepharose层析柱(包含季胺取代树脂)的结合也较不紧密。带最多负电荷的α-GalA种类在洗脱过程的晚期洗脱，且根据SDS-PAGE分析，具有较大的分子量。通过洗脱收集液备选择的合并液的等电聚焦确认根据电荷进行的分部分离。
由此，根据大小的分离和根据电荷的分离都能够用于选择高度带电的α-Gal A糖形式。
2.5甘露糖或甘露糖-6-磷酸(M6P)介导的α-GalA的内在化为了将稳定转染细胞产生的α-Gal A作为α-Gal A缺陷的有效治疗剂，本酶必须由受影响的细胞内在化。α-Gal A在生理学pH水平具有极低活性，例如在血液或组织液中。只有在溶酶体的酸性环境中内在化时，α-Gal A才最佳地代谢积累的脂类底物。这种内在化是α-Gal A与M6P受体的结合介导的，M6P受体在细胞表面表达并将酶经内吞途径递送至溶酶体。M6P受体是普遍表达的；大多数体细胞能表达M6P至一定程度。对糖蛋白上暴露的甘露糖残基特异的甘露糖受体较不普遍。甘露糖受体通常只发现于巨噬细胞和类巨噬细胞上，并提供了α-Gal A进入这些类型的细胞的额外方法。
为了证明M6P介导的α-Gal A内在化，将来自Fabry病患者的皮肤成纤维细胞(NIGMS人类基因突变型细胞储存库)(NIGMS Human GeneticMutant Cell Repository)在本发明的纯化α-Gal A浓度增加的条件下培养过夜。一些样品含有5mM可溶性M6P，它们竞争性抑制与M6P受体的结合和经M6P受体的内在化。其它样品含有30mg/mL甘露糖，它们抑制与甘露糖受体的结合和经甘露糖受体的内在化。温育后，刮到裂解缓冲液(10mM Tris(pH7.2)，100mM NaCl，5mM EDTA，2mM PdfablocTM(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)，和1％NP-40)中，清洗并收获细胞。然后测定裂解样品的蛋白质浓度和α-Gal A活性。结果以α-Gal A活性单位/mg细胞蛋白质表示。Fabry细胞以依赖剂量的方式内在化α-Gal A。这一内在化受M6P的抑制，但是不受甘露糖的抑制。因此，Fabry成纤维细胞内在化α-Gal A受M6P受体而非甘露糖受体介导。
α-Gal A还受内皮细胞的体外内在化，内皮细胞是治疗Fabry病的重要靶细胞。将人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)与7500U α-Gal A一起培养过夜；一些孔含有M6P。温育后，收获细胞并如上所述测定α-Gal A。与α-Gal A一起温育的细胞的酶水平几乎是对照(未与α-Gal A一起温育)细胞的10倍。M6P抑制α-Gal A的细胞内积累，说明HUVEC内在化α-Gal A是由M6P受体介导。由此，本发明的人α-Gal A是由临床相关细胞内在化的。
已知少数培养人细胞系表达甘露糖受体。然而，携带甘露糖受体但是少许M6P受体(如果有)的小鼠类巨噬细胞细胞系(J774.E)，可用于确定本发明的纯化α-Gal A是否经甘露糖受体内在化。Diment等人，白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Biol.)42485-490，(1987)。将J774.E细胞在存在10,000U/mL α-Gal A的条件下培养过夜。选择的样品还含有2mM M6P，而其它样品含有100mg/mL甘露糖。如上所述清洗并收获细胞，测定每份样品的总蛋白质和α-Gal A活性。M6P不抑制这些细胞摄取α-Gal A，而甘露糖将α-Gal A积累水平降低了75％。由此，在表达此特定细胞表面受体的细胞类型中，本发明α-Gal A可以由甘露糖受体内在化。实施例3.制药学配方缓冲液和配方的制备将α-Gal A的纯化批量用α-Gal A稀释剂稀释至终浓度。根据待配制的纯化批量的体积、α-Gal A浓度(mg/mL)、和α-Gal A在最终配方中的期望浓度，确定需要的α-GalA稀释液的体积。在使用前24小时内，通过混和适当量的WFI、NaCl、和磷酸钠单基，并用NaOH溶液将pH调至6.0，由此配制α-Gal A稀释液。α-Gal A稀释液的组成列于表8。
表8.α-Gal A稀释液的组成(每升)成分登记号量NaCl(USP) 100-1916 8.8gNaOH，5N200-1903 将pH调至6.0Na3PO4，单基(USP)100-1913 3.5g注射用水(USP) 100-2301 定容至1.0L将1升或更小体积的α-Gal A稀释液用无菌的0.2mm尼龙膜(NalgeNunc International公司，Rochester，NY)真空过滤。更大的体积可使用蠕动泵和0.2mm Supor囊滤器(Pall，Port Washington，NY)正压过滤。将所有滤出液进行过滤后气泡点完整性测试。在经检验的100等级层流橱中进行混和和过滤。在混和容器中向α-Gal A的纯化批量中加入α-Gal A稀释剂，得到1mg/ml的终溶液。然后，加入适当体积的聚山梨酯20(吐温20，Spectrum)至终浓度0.02％。实施例4.脱唾液酸、脱半乳糖的α-Gal A为了研究糖基化对α-Gal A的生物学分布的影响，将α-Gal A的纯化制剂连续糖基化，并将每种形式注射到小鼠中。注射后4小时采集小鼠器官，并对组织进行免疫组织化学分析，观察本蛋白质生物学分布中的可能变化。
首先用神经氨酸苷酶(唾液酸酶)处理α-Gal A以除去唾液酸残基，使半乳糖部分暴露。将经唾液酸酶处理的α-Gal A的一部分进一步与β-半乳糖苷酶反应以除去半乳糖残基，使N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAC)残基暴露。然后用N-乙酰氨基葡糖苷酶除去GlcNAC，在蛋白质上剩下核心甘露糖基团。经尾静脉将未处理的α-Gal A(对照)或本蛋白质的处理形式之一注射到小鼠中。注射后4小时，从小鼠采集肝、脾、心、肾、和肺，保存，并免疫染色以检测α-Gal A。
当与接受未处理蛋白质的对照动物进行比较时，接受经唾液酸酶处理的酶(半乳糖残基暴露)的小鼠在肝中具有更多的α-Gal A，而其它检验器官中的酶相应的较少。另外，肝中的染色模式是相当不同的。在对照动物中，α-Gal A主要位于Kupffer细胞(肝巨噬细胞)和内皮细胞，而肝细胞只有中等染色。在接受经唾液酸酶处理的α-Gal A的动物中，酶只位于肝细胞，这与已知的唾液酸糖蛋白受体知分布是一致的。当用β-半乳糖苷酶除去半乳糖残基后，脱糖基化对生物学分布的影响发生逆转。在接受不含半乳糖部分的这种蛋白质的小鼠的肝中观察到的染色模式与对照动物相似；染色主要位于Kupffer细胞和内皮细胞，而肝细胞具有少量染色。用N-乙酰氨基葡糖苷酶进一步处理α-Gal A不改变经β-半乳糖苷酶处理的蛋白质观察到的染色模式；即除去N-乙酰氨基葡萄糖残基似乎对α-Gal A的生物学分布的影响较少。实施例5用表达α-Gal A的人成纤维细胞矫正Fabry成纤维细胞为了进行基因治疗，产生α-Gal A的自身细胞植入物必须产生修饰成适用于“矫正”靶细胞中的α-Gal A缺陷的形式的酶。为了评价由经转染人成纤维细胞产生的α-Gal A对Fabry细胞的影响，将从Fabry病患者采集的成纤维细胞(NIGMS人类基因突变型细胞储存库)(NIGMS HumanGenetics Mutant Cell Repository)与α-Gal A生产细胞株(BRS-11)在Transwells(Costar，Cambridge，MA)中共培养。将Fabry细胞在12孔组织培养板中培养，有些孔含有表面可以生长细胞的插入物(Transwells，0.4mm孔径)。插入物的生长基质是多孔的，高分子能够由上层环境穿至下层环境。一组插入物包含正常人包皮成纤维细胞(HF)，分泌极低水平α-Gal A；而另一组插入物包含稳定转染的人成纤维细胞株BRS-11，分泌大量的α-Gal A。在与α-Gal A生产细胞共培养的孔中，α-Gal A能够进入培育Fabry细胞的培养基，而且可以潜在地可以由Fabry细胞内在化。
表9中的数据表明Fabry细胞内在化分泌型α-Gal A。对α-Gal A的细胞内水平监控3天。那些单独(没有插入物)培养或在存在未转染包皮成纤维细胞(HF插入物)的情况下培养的细胞具有很低的细胞内α-Gal A活性水平。然而，在第2天结束时，与α-Gal A生产细胞(BRS-11插入物)一起培养的Fabry细胞展示的酶水平与正常细胞相似(正常成纤维细胞具有25-80单位α-Gal A/mg蛋白质)。通过M6P抑制(BRS-11插入物+M6P)证明了矫正可归功于通过M6P受体摄取的α-GalA。
表9.用表达α-Gal A活性(单位/mg总蛋白质)的人成纤维细胞矫正Fabry成纤维细胞时间 无插入物 BHF插入物 BRS-11插入物 BRS-11插入物+M6P第1天 2±1 2±1 13±1 4±1第2天 2±1 2±1 40±11 6±2第3天 2±1 5±1 85±1 9±1上述描述只用于例示目的，而非将本发明限制成公开的精确形式，但是后面所附权利要求作了限制。在说明书和所附权利要求书中，除非文章中清楚指明，单数形式包括复数参考。此说明书中引用的所有专利和发表物引入作为参考。
序列表<110>Transkaryotic Therapies，Inc.
<120>α-半乳糖苷酶A缺陷的治疗<130>18082-001 PCT<140>未指定<141>2000-03-08<150>09/266,014<151>1999-03-11<160>24<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>210<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人成纤维细胞文库探针外显子7，包括扩增引物。<400>1ctgggctgta gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt 50ataccatcgc agttgcttcc ctgggtaaag gagtggcctg taatcctgcc 100tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa aggaagctag ggttctatga 150atggacttca aggttaagaa gtcacataaa tcccacaggc actgttttgc 200ttcagctaga 210<210>2<211>268<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述cDNA克隆的5’端，包括扩增引物。<400>2attggtccgc ccctgaggtt aatcttaaaa gcccaggtta cccgcggaaa 50tttatgctgt ccggtcaccg tgacaatgca gctgaggaac ccagaactac 100atctgggctg cgcgcttgcg cttcgcttcc tggccctcgt ttcctgggac 150atccctgggg ctagagcact ggacaatgga ttggcaagga cgcctaccat 200gggctggctg cactgggagc gcttcatgtg caaccttgac tgccaggaag 250agccagattc ctgcatca268<210>3<211>1343<212>DNA<213>人类<400>3ccgcgggaaa tttatgctgt ccggtcaccg tgacaatgca gctgaggaac 50ccagaactac atctgggctg cgcgcttgcg cttcgcttcc tggccctcgt 100ttcctgggac atccctgggg ctagagcact ggacaatgga ttggcaagga 150cgcctaccat gggctggctg cactgggagc gcttcatgtg caaccttgac 200tgccaggaag agccagattc ctgcatcagt gagaagctct tcatggagat 250ggcagagctc atggtctcag aaggctggaa ggatgcaggt tatgagtacc 300tctgcattga tgactgttgg atggctcccc aaagagattc agaaggcaga 350cttcaggcag accctcagcg ctttcctcat gggattcgcc agctagctaa 400ttatgttcac agcaaaggac tgaagctagg gatttatgca gatgttggaa 450ataaaacctg cgcaggcttc cctgggagtt ttggatacta cgacattgat 500gcccagacct ttgctgactg gggagtagat ctgctaaaat ttgatggttg 550ttactgtgac agtttggaaa atttggcaga tggttataag cacatgtcct 600tggccctgaa taggactggc agaagcattg tgtactcctg tgagtggcct 650ctttatatgt ggccctttca aaagcccaat tatacagaaa tccgacagta 700ctgcaatcac tggcgaaatt ttgctgacat tgatgattcc tggaaaagta 750taaagagtat cttggactgg acatctttta accaggagag aattgttgat 800gttgctggac cagggggttg gaatgaccca gatatgttag tgattggcaa 850ctttggcctc agctggaatc agcaagtaac tcagatggcc ctctgggcta 900tcatggctgc tcctttattc atgtctaatg acctccgaca catcagccct 950caagccaaag ctctccttca ggataaggac gtaattgcca tcaatcagga 1000ccccttgggc aagcaagggt accagcttag acagggagac aactttgaag 1050tgtgggaacg acctctctca ggcttagcct gggctgtagc tatgataaac 1100cggcaggaga ttggtggacc tcgctcttat accatcgcag ttgcttccct 1150gggtaaagga gtggcctgta atcctgcctg cttcatcaca cagctcctcc 1200ctgtgaaaag gaagctaggg ttctatgaat ggacttcaag gttaagaagt 1250cacataaatc ccacaggcac tgttttgctt cagctagaaa atacaatgca 1300gatgtcatta aaagacttac tttaaaaaaa aaaaaaactc gag1343<210>4<211>398<212>PRT<213>人类<400>4Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp1 5 10 15Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys20 25 30Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu
35 40 45Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp50 55 60Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln65 70 75 80Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys85 90 95Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala100 105 110Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe115 120 125Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp130 135 140Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu145 150 155 160Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr165 170 175Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys180 185 190Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile195 200 205Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp210 215 220Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly225 230 235 240Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp245 250 255Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile260 265 270Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile275 280 285Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp290 295 300Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val305 310 315 320Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile325 330 335Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe340 345 350Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp355 360 365Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu370 375 380Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu385 390 395<210>5<211>1197<212>DNA<213>人类<400> 5ctggacaatg gattggcaag gacgcctacc atgggctggc tgcactggga 50gcgcttcatg tgcaaccttg actgccagga agagccagat tcctgcatca 100gtgagaagct cttcatggag atggcagagc tcatggtctc agaaggctgg 150aaggatgcag gttatgagta cctctgcatt gatgactgtt ggatggctcc 200ccaaagagat tcagaaggca gacttcaggc agaccctcag cgctttcctc 250atgggattcg ccagctagct aattatgttc acagcaaagg actgaagcta 300gggatttatg cagatgttgg aaataaaacc tgcgcaggct tccctgggag 350ttttggatac tacgacattg atgcccagac ctttgctgac tggggagtag 400atctgctaaa atttgatggt tgttactgtg acagtttgga aaatttggca 450gatggttata agcacatgtc cttggccctg aataggactg gcagaagcat 500tgtgtactcc tgtgagtggc ctctttatat gtggcccttt caaaagccca 550attatacaga aatccgacag tactgcaatc actggcgaaa ttttgctgac 600attgatgatt cctggaaaag tataaagagt atcttggact ggacatcttt 650taaccaggag agaattgttg atgttgctgg accagggggt tggaatgacc 700cagatatgtt agtgattggc aactttggcc tcagctggaa tcagcaagta 750actcagatgg ccctctgggc tatcatggct gctcctttat tcatgtctaa 800tgacctccga cacatcagcc ctcaagccaa agctctcctt caggataagg 850acgtaattgc catcaatcag gaccccttgg gcaagcaagg gtaccagctt 900agacagggag acaactttga agtgtgggaa cgacctctct caggcttagc 950ctgggctgta gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt 1000ataccatcgc agttgcttcc ctgggtaaag gagtggcctg taatcctgcc 1050tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa aggaagctag ggttctatga 1100atggacttca aggttaagaa gtcacataaa tcccacaggc actgttttgc 1150ttcagctaga aaatacaatg cagatgtcat taaaagactt actttaa1197<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>6ctgggctgta gctatgataa ac 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>7tctagctgaa gcaaaacagt g21<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>8attggtccgc ccctgaggt 19<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>9tgatgcagga atctggctct 20<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>10ttttggatcc ctcgaggaca ttgattattg actag 35<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>11ttttggatcc cgtgtcaagg acggtgac 28<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>12ttttggatcc accatggcta 20<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>13ttttgccggc actgccctct tgaa 24<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>14ttttcagctg gacaatggat tggc 24<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>15ttttgctagc tggcgaatcc 20<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>16ttttggatcc gtgtcccata gtgtttccaa 30<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>17ttttggatcc gcagtcgtgg ccagtacc 28<210>18<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述插入寡聚物<400>18ctagtcctag ga 12<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>19ttttgagcac agagcctcgc ct 22<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述部分胶原蛋白启动子<400>20ttttggatcc ggtgagctgc gagaatagcc 30<210>21<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述部分胶原蛋白启动子<400>21gggcccccag ccccagccct cccattggtg gaggcccttt tggaggcacc 50ctagggccag gaaacttttg ccgtat 76<210>22<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述部分胶原蛋白启动子<400>22aaatagggca gatccgggct ttattatttt agcaccacgg ccgccgagac 50cgcgtccgcc ccgcgagca 69<210>23<211>86<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述部分胶原蛋白启动子<400>23tgccctattt atacggcaaa agtttcctgg ccctagggtg cctccaaaag 50ggcctccacc aatgggaggg ctggggctgg gggccc86<210>24<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述PCR引物<400>24cgcggggcgg acgcggtctc ggcggccgtg gtgctaaaat aataaagccc 50ggatc 5权利要求
1.含人α-Gal A制剂的组合物，如SDS-PAGE或反相HPLC测量，纯化至至少99.5％同质性，其中所述制剂包含多种α-Gal A糖形式且具有至少3.0×106单位/mg蛋白质的比活性，而且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。
2.权利要求1的组合物，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖至少35％带电荷。
3.权利要求1的组合物，如Z数目测量的，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖电荷超过150。
4.权利要求1的组合物，其中所述α-Gal A糖形式的总聚糖至少60％唾液酸化。
5.权利要求4的组合物，其中所述制剂的循环半衰期延长。
6.用于生产含多种α-Gal A糖形式的纯化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤a)在平衡缓冲液中于酸性pH使所述α-Gal A糖形式结合阳离子交换树脂，b)用所述平衡缓冲液清洗所述树脂以洗脱未结合的物质，并c)使用选自下组的洗脱溶液洗脱所述α-Gal A糖形式10-100mM的盐溶液、pH4-5的缓冲液、及其组合，其中所述α-Gal A制剂纯化至至少99.5％同质性，且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。
7.权利要求6的方法，还包括选自下组的纯化步骤层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、和免疫亲和层析法。
8.含多种α-Gal A糖形式的α-Gal A制剂，纯化至至少99.5％同质性，由权利要求6的方法生产。
9.用于生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤a)将编码GlcNac转移酶III(GnT-III)的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源GnT-III基因的表达；b)在能够表达α-Gal A和GnT-III的培养条件下培养所述α-Gal A生产细胞；并c)分离α-Gal A，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A多。
10.权利要求9的方法，其中所述α-Gal A制剂的寡糖至少35％带电荷。
11.权利要求9的方法，其中所述α-Gal A制剂包含多种糖形式，所述糖形式的复合聚糖至少20％含2-4个唾液酸残基。
12.权利要求9的方法，如Z数目测量的，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷超过150。
13.权利要求9的方法，其中所述制剂包含多种糖形式，所述糖形式平均至少25-50％磷酸化。
14.寡糖电荷增加、由权利要求9-13任一项的方法生产的糖基化α-Gal A制剂。
15.用于生产寡糖电荷增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤a)将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源唾液酰基转移酶的表达；b)在能够表达α-Gal A和唾液酰基转移酶的培养条件下培养所述α-Gal A生产细胞；并c)分离α-Gal A，其中所述α-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A多。
16.权利要求15的方法，还包括下列步骤d)通过分离或纯化步骤(c)的制剂来选择大小或电荷增加的α-GalA糖形式。
17.寡糖电荷增加、由权利要求15或16的方法生产的糖基化α-GalA制剂。
18.用于生产唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括使α-Gal A生产细胞接触铵浓度低于10mM的培养基的步骤。
19.权利要求18的方法，其中接触步骤包括用新鲜培养基连续或间歇灌注所述α-Gal A生产细胞以维持铵浓度低于10mM。
20.用于生产磷酸化增加的糖基化α-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤a)将表达后编码磷酸转移酶的多核苷酸导入α-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源磷酸转移酶的表达；b)在导致α-Gal A和磷酸转移酶表达的培养条件下培养所述α-GalA生产细胞；并c)分离α-Gal A，其中所述α-Gal A制剂的磷酸化比不含所述多核苷酸的细胞产生的α-Gal A多。
21.磷酸化增加、由权利要求20的方法生产的糖基化α-Gal A制剂。
22.生产寡糖链上唾液酸和末端半乳糖残基数目减少的糖基化α-Gal A的方法，所述方法包括下列步骤a)将α-Gal A接触神经氨酸苷酶(唾液酸酶)以除去唾液酸残基，并使末端半乳糖部分暴露；并b)将步骤(a)的脱唾液酸α-Gal A接触β-半乳糖苷酶以除去末端半乳糖残基，其中步骤(b)的脱唾液酸，脱半乳糖α-Gal A产物寡糖链上的末端唾液酸或半乳糖残基数目比来自来接触α-Gal A的α-Gal A减少。
23.用于生产寡糖链上末端半乳糖残基数目减少的糖基化α-Gal A的方法，所述方法包括将α-Gal A接触β-半乳糖苷酶以除去末端半乳糖残基的步骤，其中产物寡糖链上的末端半乳糖残基数目比未接触α-Gal A的α-Gal A减少。
24.由权利要求23的方法生产的脱半乳糖α-Gal A制剂。
25.α-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.05-5.0mg剂量的所述α-Gal A制剂。
26.权利要求25的用途，其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用大约0.2mg剂量的所述α-Gal A制剂。
27.权利要求25或26的用途，其中所述剂量配制用于肌肉内、口、直肠、皮下、动脉内、腹膜内、大脑内、鼻内、鞘内、穿粘膜、穿真皮、或经吸入施用。
28.α-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于一周一次或两周一次皮下每kg受治疗者体重施用0.01-10mg剂量的所述α-Gal A制剂。
29.权利要求27或28的用途，其中所述剂量配制用于使用选自下组的投递系统的施用泵投递、包囊细胞投递、脂质体投递、针头投递注射、无针头注射、喷雾器、气雾器、电穿孔、和透皮贴。
30.α-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于治疗Fabry病，其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.01-10mg剂量的所述α-Gal A制剂。
31.权利要求30的用途，其中所述药剂配制用于皮下施用。
32.α-Gal A制剂在制药中的用途，药剂用于治疗非典型性变异型Fabry病，其中所述药剂用于一周一次或两周一次每kg受治疗者体重施用0.05-5.0mg剂量的所述α-Gal A制剂。
33.权利要求32的用途，其中所述患者患有心血管异常。
34.权利要求33的用途，其中所述心血管异常是左心室肥大(LVH)。
全文摘要
本发明提供了高纯度的α－Gal A及其多种纯化方法;电荷改变的α－Gal A制剂及其制备方法;在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α－Gal A制剂及其制备方法;以及对受治疗者施用α－Gal A制剂的方法和剂量。
文档编号C12N9/24GK1354796SQ00807312
公开日2002年6月19日 申请日期2000年3月9日 优先权日1999年3月11日
发明者R·F·赛尔顿, M·布罗斯克, C·M·克诺施塔, D·A·瑞寇, M·D·维拉姆斯, T·J·舒特兹, P·F·达尼尔 申请人:核转移治疗公司