以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种W硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基 乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法。
【背景技术】
[0002] 随着基因工程技术、基因组学和蛋白质学技术的发展，重组蛋白已经广泛应用于 生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域。然而，大规模生产和纯化性状确切的蛋白仍然是 重组蛋白技术中的难点。重组蛋白的表达系统有原核和真核两大类。真核表达体系有酵母、 昆虫和哺乳动物细胞表达体系等。相对于真核表达体系的繁琐过程和较高的成本，W大肠 杆菌为代表的原核表达体系具有宿主菌背景清晰、表达量高、易于操作和生产成本低等诸 多优点。
[0003] 在规模化生产重组蛋白过程中，合适的融合标签对于目标蛋白的可溶性表达和下 游的蛋白纯化与检测均具有举足轻重的作用。常用的融合标签包括蛋白质标签和多肤片段 标签。大的蛋白质标签有谷脫甘肤S-转移酶（GST)，麦芽糖结合蛋白（MBP)，硫氧还原蛋白 A(TrxA),葡萄球菌蛋白A(SPA),小泛素相关修饰蛋白（SUMO)等，它们的使用会增加目标蛋 白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。常见的小的多肤标签有六 聚组氨酸化X化S)、流感病毒血凝素表位（HA)、人c-myc蛋白表位（c-myc)、W及8个氨基 酸值Y邸孤DK)组成的一个短肤FLAG标签等。利用上述标签，可W通过亲和层析技术纯化 目标蛋白。虽然运些标签各具优点并得到广泛应用，但在规模化制备和纯化蛋白时，仍存在 成本高的缺点。因此，研究和开发新的融合标签用于蛋白质的高效表达和纯化仍然很有必 要。
[0004] 凝集素是各种植物，无脊椎动物和高等动物均存在的一类对糖蛋白上的糖链具 有高度特异性的结合蛋白。可专一识别某种糖并与之非共价地、可逆地结合，如刀豆素与 a-D-化喃糖基甘露糖（a-D-Mannopyranosy)结合；麦芽素与N-乙酷糖胺（N-acet^ glucosamine)结合；菜豆凝集素与N-乙酷乳糖胺结合。利用凝集素与某种糖特异、可逆结 合的特性，在实验室中，将凝集素与固相载体结合来纯化各种糖类和糖蛋白，同时也用偶联 于固相介质上的某种糖来纯化凝集素。1994年Konska等人从硫横菌中分离出能特异性结 合N-乙酷氨基乳糖的溶血性凝集素--硫横磨茹菌凝集素化onskaG,GuillotJ,Dusser M,etal.IsolationandCharacterizationofanN-Acetyllactosamine-BindingLectin fromtheMushroomLaetiporussulfurous.JBiochem, 1994, 116(3):519-23),Hiroaki 等研究发现该凝集素可W结合琼脂糖（Se地arose),并能用乳糖竞争性洗脱（Tateno H,GoldsteinIJ.Molecularcloning,expression,andcharacterizationofnovel hemolyticlectinsfromthemushroomLaetiporussulphureus,whichshowhomology tobacterialtoxins.JBiolChem. 2003, 278 (42): 40455-40463)。因此，本研究拟在利用 硫横菌磨茹凝集素作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白表达与纯化的高效、廉价方 法。但是，由于天然的硫横菌磨茹凝集素基因较长，完整的基因有900多个核巧酸，翻译成 约300个氨基酸，不适于用作融合蛋白标签进行目标蛋白的高效表达。现有的研究表明，天 然硫横菌磨茹凝集素与乳糖结合的功能域主要位于N端的第1-187为氨基酸，因此，本申请 只表达硫横菌磨茹凝集素N端的第1-187个氨基酸组成的区域（简称为硫横菌磨茹凝集素 N-乙酷氨基乳糖结合域）作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白高效表达与纯化的方 法。该硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖结合域的氨基酸序列为SEQIDNO. 2所示的氨 基酸序列，大小为21. 3kDa，编码该区域的基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 3所示的核巧酸 序列，长度为56化P。
[0005] 此外，由于每种生物在对基因进行翻译时对密码子的利用率有较大差异，运种差 异直接影响基因表达的水平。而磨茹凝集素作为一种真菌蛋白，其密码子在大肠杆菌中的 利用率较低，将直接导致后续的标签蛋白和目的蛋白的表达量较低，而且容易导致表达的 蛋白不可溶。为了解决运个问题，本发明根据大肠杆菌密码子嗜好性，对天然的硫横菌磨茹 凝集素N-乙酷氨基乳糖结合域的基因序列进行优化，使其密码子在大肠杆菌中具有高利 用率，使得硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域可在大肠杆菌中高水平、可溶性表 达，从而提供一种W硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋 白表达与纯化方法。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人工优化合成的能够编码 硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的L化基因；本发明的另一目的是提供含有上 述人工合成的LSL基因的表达载体和宿主细胞；本发明的再一目的是提供一种W硫横菌磨 茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明首先提供了一种编码硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的LSL 基因，所述L化基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示，所述L化基因编码的蛋白的氨基酸 序列如沈QIDNO. 2所示。
[0009] 本发明还提供了一种包含所述的L化基因的表达载体。
[0010] 优选地，上述的包含L化基因的表达载体为祀T28a-LSL所述表达载体 祀T28a-L化是W祀T28a(+)为起始质粒载体构建的，所述表达载体祀T28a-L化还包括化O I限制性核酸内切酶识别位点、化nI限制性核酸内切酶识别位点、BamHI限制性核酸内切 酶识别位点和蛋白酶识别位点。
[0011] 进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含上述的L化基因 (其核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示）的宿主细胞，或者为包含上述表达载体的宿主细胞。
[0012] 本发明还提供了一种利用上述L化基因编码合成的硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨 基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，包括W下步骤：
[0013] (1)标签基因的构建：
[0014] 人工合成编码硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域的L化基因，所述LSL 基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示，然后在L化基因的5'端加上限制性核酸内切酶1 的识别位点，在其3'端依次加上限制性核酸内切酶2的识别位点、蛋白酶识别位点和限制 性核酸内切酶3的识别位点，形成标签基因；
[0015] (2)表达载体1的构建：
[0016] 用限制性核酸内切酶1和3对标签基因进行双酶切处理，然后将双酶切后回收得 到的含有L化基因的基因片段用DNA连接酶与经过同样双酶切处理的大肠杆菌表达载体进 行连接，得到含有L化基因片段的表达载体1;
[0017] (3)表达载体2和表达载体3的构建：
[0018]a.目标蛋白基因序列的合成：参照目标蛋白的基因序列，人工合成目标蛋白基 因，并在目标蛋白基因的5'端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，在其3'端加上限制性 核酸内切酶4的识别位点；
[0019]b.用限制性核酸内切酶3和4分别对合成的目标蛋白基因序列、表达载体1进行 双酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的目标蛋白基因序列和表达载体1进 行连接，得到包含L化基因和目标蛋白基因的表达载体2;
[0020] C.蛋白酶基因序列的合成：参照蛋白酶的基因序列，人工合成蛋白酶基因，并在 蛋白酶基因的5'端加上限制性核酸内切酶2的识别位点，在其3'端加上限制性核酸内切 酶3的识别位点，其中，所述蛋白酶为与步骤（1)中蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶；
[0021] d.用限制性核酸内切酶2和3分别对合成的蛋白酶基因序列、表达载体1进行双 酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的蛋白酶基因序列和表达载体1进行连 接，得到包含L化基因和蛋白酶基因的表达载体3;
[0022] (4)融合蛋白的诱导表达：
[0023]a.将表达载体2和3分别转化至宿主菌中，然后进行鉴定，挑选出含有表达载体2 的阳性克隆菌和含有表达载体3的阳性克隆菌，分别进行发酵培养，并加入IPTG诱导重组 蛋白的表达，所述IPTG的浓度为0. 2-1.Ommol/L;
[0024]b.发酵培养结束后，将两种发酵产物分别进行离屯、处理，各自收集菌体沉淀；然 后分别用细菌裂解液重悬菌体，超声破碎菌体，离屯、并收集上清，分别得到表达产物2和表 达产物3
[00巧](5)融合蛋白的分离纯化：
[0026]a.融合蛋白2的分离纯化：将表达产物2上样至凝胶过滤层析柱上，静置 3-lOmin，然后打开凝胶过滤层析柱的下水口，控制流速为