0. 5-lmL/min，然后向凝胶过滤层 析柱中加入30-60倍柱床体积的PBS缓冲液进行洗涂处理，同时收集下水口流出的洗涂液 并进行检测，当收集到的洗涂液中检测不到蛋白时，向凝胶过滤层析柱中加入洗脱液进行 洗脱处理，控制洗脱液的流速为0. 4-lmL/min，并收集洗脱液，得到纯化的融合蛋白2;
[0027]b.融合蛋白3的分离纯化：融合蛋白3的分离纯化方法与融合蛋白2相同，经过 分离纯化，得到纯化的融合蛋白3;
[0028](6)蛋白标签的切除：
[0029] 按质量比巧-20) :1的比例取纯化后的融合蛋白2和融合蛋白3,加入到与步骤 (1)中的蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶的酶切反应缓冲液中，进行酶切反应；其中，融合 蛋白3可酶切融合蛋白2,形成游离的硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域标签蛋 白和目标蛋白；
[0030] (7)目标蛋白的回收：
[0031] 将酶切反应后的反应液上样至凝胶过滤层析柱，静置3-lOmin，融合蛋白3和硫横 菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域标签蛋白被结合至凝胶过滤层析柱上，目标蛋白 不结合凝胶过滤层析柱而流出，收集流穿液，即得到纯化的目标蛋白。
[0032] 根据上述的方法，所述限制性核酸内切酶1优选为化OI;所述限制性核酸内切酶 2优选为化nI;所述限制性核酸内切酶3优选为BamHI;所述限制性核酸内切酶4优选为 HindIIIo
[0033] 根据上述的方法，步骤似中所述的大肠杆菌表达载体上含有限制性核酸内切酶 1、3和4的识别位点。
[0034] 根据上述的方法，步骤（2)中所述的大肠杆菌表达载体优选为祀T系列载体；更优 选的，所述的大肠杆菌表达载体为祀T28a(+)。
[0035] 根据上述的方法，优选地，步骤（3)中所述的蛋白酶为烟草蚀纹病毒病蛋白酶、肠 激酶、凝血酶中的任意一种；其中，所述蛋白酶与蛋白酶的识别位点如表1所示。
[0036] 表1蛋白酶与蛋白酶识别位点
[0038] ~根据上述的方法，步骤（3)中所述的蛋白酶更优选为烟草蚀纹病毒病蛋白酶。
[0039] 根据上述的方法，步骤（4)中所述的宿主菌优选为大肠杆菌，更优选为 EscherichiaCOli化21 0E3);含有表达载体2的阳性克隆菌和含有表达载体3的阳性克 隆菌的发酵培养的培养基、培养条件与培养宿主菌的培养基和培养条件相同。
[0040] 根据上述的方法，步骤（4)中所述IPTG的浓度优选为1.Ommol/L;诱导溫度为 20-37°C，优选为25°C;诱导时间为4-化，优选为化。
[0041] 根据上述的方法，步骤巧）中所述洗脱液优选为乳糖，其浓度优选为0. 1-0. 4mol/ L其浓度更优选为0. 2mol/L。
[0042] 根据上述的方法，步骤（5)和步骤（7)中所述的凝胶过滤层析柱优选为琼脂糖凝 胶过滤层析柱，其凝胶填料为Se地arose4B。
[0043] 根据上述方法，步骤化）中所述的酶切反应的反应溫度为4-30°C，优选反应溫度 为20-30°C;酶切反应时间为l-16h，优选为1-地。
[0044] 本发明的积极有益效果：
[0045] (1)本发明实现了目标蛋白的一步纯化：本发明的目标蛋白表达纯化方法是在需 要纯化的目标蛋白的N端连接硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域作为蛋白纯化 标签，实现重组蛋白的纯化。此体系的优点在于硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合 域可特异性结合琼脂糖，并能用乳糖竞争性洗脱，因此，利用硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨 基乳糖胺结合域作为蛋白纯化标签，实现了目标蛋白的一步纯化，而且能形成一种简便、高 效、经济的纯化所需目的重组蛋白的体系。
[0046] (2)本发明可W实现硫横菌磨茹凝集素N-乙酷氨基乳糖胺结合域蛋白标签一步 法切割并除去，获得目标蛋白：利用本发明构建的重组蛋白表达纯化方法，还可W表达纯化 带有L化标签的蛋白酶，本发明在L化标签和目标蛋白之间插入了与该蛋白酶相匹配的蛋 白酶识别位点，因此，可W利用带L化标签的蛋白酶将目标蛋白上的L化标签切割下来；酶 切反应后，只需经过琼脂糖凝胶过滤层析柱即可将带有L化标签的蛋白酶和切下的L化标 签与目标蛋白分离开，最终得到单一组分的目标蛋白，而且得到的目标蛋白具有近乎天然N 末端。
[0047] (3)本发明的方法大大降低了目标蛋白的纯化成本：蛋白表达和纯化的成本主要 取决纯化用的介质，本发明中的目标蛋白表达纯化方法对纯化介质Se地arose-4B没有特 殊要求，也无需经过特殊处理，使用过的Se地arose-4B经过乳糖洗脱液洗净残留的蛋白， 随后用双蒸水冲洗，将柱中的乳糖洗净即可重复使用，因此，本发明方法中目标蛋白的纯化 成本较目前商品化的蛋白质纯化方法的成本大大降低；而且，纯化等量的蛋白其成本约为 常用商品化縷柱纯化方法的1/10。
[0048] (4)本发明可W实现目标蛋白的规模化生产：本发明的目标蛋白表达纯化方法操 作简单，标签易去除，洗脱方便，可获得高纯度的目标蛋白，实现了目标蛋白的一步纯化，极 大地节省了蛋白纯化的时间，同时也节省了人力、物力，极大地降低了蛋白纯化的成本，可 W广泛用于生物医药、兽药等领域中的活性蛋白质，W及生物制品行业中疫苗抗原的规模 化制备，具有较高的实用价值和重要的经济意义。
【附图说明】
[0049] 图1表达载体祀T28a-L化的酶切鉴定结果图（其中，M为DNAmarker;1为 pET28a(+)对照；2为化OI和BamHI双酶切后的祀T28a-L化）；
[0050] 图2表达载体祀T28a-L化-Cap和祀T28a-L化-TEV的酶切鉴定结果图（其中，M 为DNAmarker;1为祀T28a-L化对照；2为KpnI和BamHI双酶切后的祀T28a-L化-TEV; 3为BamHI和HindIII双酶切后的祀T28a-L化-Cap);
[0051] 图3L化-Cap融合蛋白的表达与纯化后的SDS-PAGE结果图（其中，M为低分子量 蛋白marker; 1为未经诱导培养的含有祀T28a-L化-Cap表达载体的宿主菌中LSkCap融合 蛋白的表达；2为经诱导培养的含有祀T28a-L化-Cap表达载体的宿主菌中L化-Cap融合蛋 白的表达；3为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSkCap融合蛋白）；
[0052] 图4L化-TEV融合蛋白的表达与纯化后的SDS-PAGE结果图（其中，M为低分子量 蛋白marker;1为未经诱导培养的含有祀T28a-L化-TEV表达载体的宿主菌中LSkTEV融合 蛋白的表达；2为经诱导培养的含有祀T28a-L化-TEV表达载体的宿主菌中LSkTEV融合蛋 白的表达；3为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSkTEV融合蛋白）；
[0053] 图5酶切反应后的反应液样品和反应液样品用琼脂糖凝胶柱纯化后得到的Cap蛋 白样品的SDS-PAGE结果图（M为低分子量蛋白marker; 1为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSkCap 融合蛋白；2为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSkTEV融合蛋白；3为酶切反应后的反应液样品；4 为酶切反应后的反应液样品用琼脂糖凝胶柱纯化后得到的Cap蛋白样品）。
【具体实施方式】
[0054] W下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限 审IJ。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。
[0055] 除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规 试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
[0056]W下本发明W猪圆环病毒II型衣壳蛋白Cap(Cap蛋白的大小为24kDa，其Cap基 因的长度为57化P)作为目标蛋白，来详细阐述本
【发明内容】
的具体实施。
[0057] 菌种和试剂：
[0058]pET28a(+)质粒、EscherichiaCOliD册a和化21值E3)均购自宝生物工程（大 连）有限公司，DNA聚合酶、限制性内切酶化OI、化nI、BamHI、HindIII和T4DNA连接 酶购自肥B(北京）有限公司，质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自 Qiagen公司，S巧ha;rose-4B、卡那霉素、异丙基-0-D-硫代半乳糖巧（IPTG)购自Sigma公 司。憐酸盐缓冲液（PB巧的组成：10mmol/L憐酸钢、0. 15mol/L化C1、0. 04%叠氮钢，PH7. 2。 细菌裂解液：细菌裂解液为含有NonidetP-40、PMSF和2-琉基乙醇S种成分的PBS缓冲 液（pH7. 2)，其中，NonidetP-40的含量为1%，PMSF的浓度为lmmol/L，2-琉基乙醇的浓 度为Immol/L。IOXTEV反应缓冲液：50mmol/LTris-肥 1(抑8.0)、0.5mmol/L邸TAUmmol/ LDTT。LB固体培养基：膜蛋白腺lOg，酵母粉5g，氯化钢lOg，琼脂粉lOg，加水至1000血， pH调为7. 2。LB液体培养基：膜蛋白腺lOg，酵母粉5g，氯化钢lOg，加水至1000 mL,pH调为 7. 2。
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