棉花植物事件aC20-3以及用于其检测的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，尤其是农业生物技术研究中的转基因农作物育 种领域，特别是涉及具有改良棉花纤维品质的棉花转化事件aC20-3,W及检测该转化事件 的特有方法。
【背景技术】
[0002] 棉花纤维是棉花生产的主要产品，棉花纤维的产量和品质直接决定了棉花生产的 产值和效益。因此，提高棉花纤维品质一直是棉花育种的主要目标。但是棉花的产量和品质 均为数量性状，受到多种因素的影响并且产量与品质之间存在负相关，严重阻碍着棉花纤 维品质和产量的同步改良。棉花栽培品种主要是陆地棉，而优良纤维品质基因主要源于二 倍体的瑟伯氏棉（纤维强度）、异常棉（纤维强度与细度）W及四倍体的海岛棉（纤维强度 与细度）等。送些优良性状基因的利用，在常规育种中却受到诸多限制，单靠现有的棉花遗 传种质资源和常规育种手段已经难W大幅度提高棉花产量，难W满足快速发展的纺织工艺 革命对纤维品质的要求。利用基因工程技术育种可W打破物种间的遗传障碍，实现优良目 的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定，育种周期短等优点，送为棉花纤维产量和品质 的改良提供了新的途径。但是目前人们还未得到与棉花纤维形成，W及产量和品质（强度、 细度和长度等）直接相关的基因，使得利用基因工程改良棉花纤维缺乏有效的目的基因。
[0003] 棉纤维的品质主要由棉花纤维细胞的分化与发育阶段决定，是一个复杂有序的过 程，在不同的发育时期均有大量的基因表达，参与纤维细胞发育的调控。棉纤维细胞由胚珠 外珠被单个细胞分化而来，是高等植物中伸长最快、合成纤维素最多的模式单细胞。其分化 和发育过程可分为纤维细胞分化与突起、纤维细胞的迅速伸长、次生壁的合成和脱水成熟4 个时期，是多种基因共同表达调控的复杂过程。其中纤维伸长和次生壁合成两个时期部分 重叠，对纤维的发育与品质形成关系密切。棉纤维的品质主要包括纤维长度、强度、伸长 率、马克隆值等性状。纤维的起始与伸长直接影响到纤维的数量与长度，而次生壁加厚期纤 维素的合成则影响纤维的强度与麦克隆值等性状。人们对棉花纤维发生、发育和品质形成 的分子机理也知之甚少。送些都极大的阻碍了对棉花纤维进行产量和品质改良的进程。
[0004]目前通过分子生物学手段改良棉花纤维品质的思路主要是通过植物转基因技术 导入能调控棉花体内激素、纤维素及多糖合成的基因。化hn等（1996)将己醜CoA还原酶基 因（地aB)和P皿合酶基因（PhaC)导入到陆地棉栽培种中，转基因棉纤维品质如强度、长度 等虽然没明显的改良，但转基因棉花的吸热性和导热性能明显增加。化hn(1999)将与生长 素合成相关的基因iaaM和ia址导入常规棉花中，虽然转基因棉纤维中IAA的含量显著地 增加，然而纤维长度、细度和强度与对照相比没有显著差异。Jiang等（2011)将纤维素合酶 基因（化SusAl)转入棉花中，结果表明过度表达化SusAl基因的棉花株系纤维品质明显高 于非转基因株系。
【发明内容】
[0005] 本发明人通过转基因方法获得了转基因事件aC20-3的棉花品系。该转化事件 具有稳定的改良棉花纤维品质的性状。其代表性种子已保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中必，保藏编号为；CGMCCNo. 8880,分类命名为陆地棉，拉了文名称是 Gossypiumhirsutum，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所，保藏日期为2014年5月8日。
[0006] 本发明第一方面提供棉花转化事件aC20-3,其特征序列如SEQIDNo;21所示， 其由第1118-6544bp的T-DNA插入序列、第l-1117bp的上游侧翼棉花基因组序列和第 6545-738化P的下游侧翼棉花基因组序列构成。
[0007]本发明第二方面提供一种核酸构建体，其包含所述棉花转化事件aC20-3。
[000引本发明第H方面提供一种重组载体，其包含本发明第一方面所述的T-DNA插入序 列或含有棉花转化事件aC20-3的核酸构建体。在一个实施方案中，所述载体为说明书附图 1 中的p2300-pE200-mCBD载体。
[0009] 本发明第四方面提供一种重组细胞，含有本发明第一方面所述的T-DNA插入序列 或本发明第二方面所述的核酸构建体或本发明第H方面所述的载体，所述重组细胞为重 组农杆菌细胞。
[0010] 本发明第五方面提供用于检测本发明第一方面所述的棉花转化事件的引物对，其 由特异性识别本发明第一方面所述的T-DNA插入序列的第一引物和特异性识别本发明第 一方面所述的任一侧翼序列的第二引物组成。在一些实施方案中，所述第一引物选自SEQ IDNO或23时，所述第二引物选自SEQIDNO;14或16。在另一些实施方案中，所述第 一引物选自沈QIDNO;18或24时，所述第二引物选自沈QIDNO;25或19。
[0011] 本发明第六方面提供一种鉴定棉花生物样品中aC20-3转基因事件的方法，其包 括：
[001引 （a)从待鉴定的棉花生物样品提取DNA样品；
[001引 化）W提取的DNA样品为模板，使用权利要求6或7所述的引物对进行PCR扩增；
[0014] (C)检测PCR扩增产物，如果扩增产物长度与SEQIDNO;21上所述PCR引物对的 序列之间的长度一致，则表明棉花生物样品中aC20-3转基因事件的存在。
[0015] 本发明第走方面提供了一种制备转基因棉花的方法，培养含有本发明第一方面所 述的转化事件的棉花种子或其他组织，包括：利用含有本发明第一方面所述的转化事件材 料的棉花材料，与其它棉花育种材料进行杂交后，进一步进行回交，获得含有本发明第一方 面所述的转化事件的新材料；在杂交及回交过程中，利用本发明第六方面的方法在后代群 体中进行筛选鉴定，确认本发明第一方面所述的转化事件的存在。
[0016] 本发明第八方面提供本发明第一方面所述的转化事件、发明第二方面所述的核酸 构建体、发明第H方面所述的重组载体、发明第四方面所述的重组细胞、发明第六方面或发 明第走方面所述的方法用于提高棉花纤维品质、进行植物育种W及用作分子标记的用途。
[0017] 本发明中利用的编码CBD蛋白的Cbd基因（GenBank;AAA23218. 1)来源于食纤维 梭菌（ClostridiumcelIulovorans)，该CBD蛋白是1990年由0.化oseyov从食纤维梭菌 中纯化到的纤维素酶复合物的组成成分，该复合物对微晶纤维（crystallinecelluose)有 纤维酶的活性。实验表明若将CB化从纤维素酶或纤维小体的脚手架结构中去除将极大的 降低酶活。E.Shpigel对CBDs的功能研究发现，CBDs能在体外增强PrunuspersicaL花 粉管的伸长；增加A.Xylinum纤维素合成酶的活性，促进纤维素的合成。其中SP序列来自 拟南芥CELl基因的N端24个碱基，为导肤序列。本发明利用纤维特异性启动子EV0200驱 动SP+mCBD基因，利用农杆菌介导的方法转化棉花，通过筛选获得棉纤维衣份、比强和马克 隆值均有明显改善的单拷贝转化事件aC20-3,并利用分子生物学手段获得了该插入事件左 右两侧的棉花基因组序列。
[0018] 本发明创造出的mC抓基因的优质棉花转化事件不仅可W显著改善棉花纤维品 质，遗传稳定、单拷贝整合且整合侧翼序列分子特征清楚，在生产育种中具有重要应用价 值，而且由于具有独特的检测方法，可方便地通过杂交聚合的方式聚合不同的商业化转化 事件。
【附图说明】
[0019] 图1示出了植物表达载体p2300-pE200-mCBD的构建流程。
[0020] 图2示出了利用Southern杂交技术对转基因事件aC20-3拷贝数进行检测的实验 结果。1，经化ndIII酶切的含mCBD基因的质粒；2,经EcoRI酶切的转化事件aC20-3基 因组DNA件；3,经HindIII酶切的转化事件aC20-3基因组DNA;Marker，经EcoRI/Hind III酶切的ADNA;
[0021] 图3是右边界（RB)旁侧序列示意图。
[00过图4是左边界（LB)旁侧序列示意图。
[0023] 图5是aC20-3事件的插入序列及鉴定引物的示意图。
[0024]图 6 示出 了利用引物对RBcheckSl' /GSP2-mCBD32 '、RBcheck52 ' / GSP2-mCBD32'W及LBcheck31' /GSP2-NPTII52'、LBcheck32' /GSP2-NPTII52'分别 扩增aC20-3事件和冀棉14的棉花样品结果。M，marker,ADNA/EcoRI+HindIII;1， 3 ;RBcheck51' /GSP2-mCBD32 '扩增aC20-3 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 1767bp;2， 4 ;RBcheck52' /GSP2-mCBD32'扩增aC20-3 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 1535bp;5,6 : LBcheck31' /GSP2-NPTII52 '扩增aC20-3 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 3197bp;8,7 : LBcheck32' /GSP2-NPTII52'扩增aC20-3 事件和冀棉 14,阳性扩增条带 3152bp。
【具体实施方式】
[002引在本发明中，"转化事件"是指外源插入DNA序列和特定棉花基因组DNA序列 的接合。"转化事件"并不是一种植物细胞或植株，植物细胞或植株是转化事件存在的载 体；转化事件的核必特征是外源基因在植物基因组中特定位点的插入所形成的外源插入序 列和特定棉花基因组序列连接的一段特征DNA序