列。
[0026] 具有某个转化事件的植物品系被称为相同名称的品系。例如，具有aC20-3转化事 件的植物品系被称为曰C20-3品系。
[0027] 实施例
[002引下面结合非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
[0029] 实施例1.植物表达载体构建
[0030] 因编码纤维素结合域CBD(cellulosebindingdomain)基因来源于食纤维梭菌， 其GC含量及密码子偏好性与棉花基因组有所差异，因此根据棉花密码子偏好改变其碱基 组成，用人工合成的方法合成SP和CBD基因融合序列（序列如SEQIDNo;I所示），其中SP序列来自拟南芥CELl基因的N端24个碱基为导肤序列。融合序列委巧化kara公司进 行全基因人工合成，新基因命名为SP+mCBD。选择植物双元表达载体PCAMBIA2300 (购自北 京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）作为植物表达载体，用化OS启动子替换NPTn基因含 双增强子的35S启动子，W降低NPTII蛋白在植物中的表达。选取来自棉花纤维伸长早期 特异表达的启动子EV0200(序列如SEQIDNo;2所示），驱动融合基因的表达，W化OS作 为终止子。
[003。用引物沈QIDNO;3和沈QIDNO;4W植物表达载体PBI12U购自北京华夏远洋 科技有限公司）为模板扩增化OS,采用TaKaRa的PrimeSTAR服DNA聚合酶。50U1PCR反 应体系；l0y15XPSBuffer，3y12.SmM的dNTP，l.Oy1PBI121，1.OylPrimeSTAR、10yM 的引物沈QIDNO;3和沈QIDNO;4各2.0y1，W及31yI的双蒸水。PCR反应条件；94°C 预变性5min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，33个循环后，72°C延伸lOmin。通 过EcoRI、BamHI酶切连接到pCAMBIA2300(promega，T4 连接酶盒）获得PCAMBIA2300-1。
[0032] 用引物沈QIDNO;5和沈QIDNO;6WPBI121为模板扩增Tnos,采用TaKaRa 的PrimeSTAR服DNA聚合酶。50UlPCR反应体系；10U15XPSBuffer, 3U12. 5mM的 (1饥？，1.0111?81121，1.0111口'11116514尺、10111的引物沈9 10側；5和沈9 10側；6 各2.0111，^及3川1的双蒸水。？〇?反应条件；941：预变性5111111，941：变性303,581： 退火3〇3,721：延伸3〇3,33个循环后，721：延伸1〇111111。通过53〇1、￡(3〇1?1酶切连接到 PCAMBIA2300-1(promegaT4 连接酶盒）获得PCAMBIA2300-2
[003引用引物SEQIDNO;7和SEQIDNO;8W非洲棉（国家棉花中期库，获取单位中国棉 花研究所，统一编号；ZM-06838)DNA为模板扩增棉花EV0200启动子（参考卢东柏等.改良 SDS法提取棉花基因组DNA研究.广东农业科学，2008 (5) ; 14-16中的方法提取棉花DNA)。 采用TaKaRa的PrimeSTAR服DNA聚合酶。50UlPCR反应体系；IOy15XPSBuffer, 3U12. 5mM的dNTP，1. 0U1 棉花DM, 1. 0U1PrimeSTAR、10UM的引物沈QIDNO;7 和沈Q IDNO;8各2. 0U1，W及31U1的双蒸水。PCR反应条件；94°C预变性5min，94°C变性30s， 58°C退火30s，72°C延伸30s，33个循环后，72°C延伸IOmin。通过HindIII、BamHI酶切连 接到（连接方法同上）PCAMBIA2300-2获得PCAMBIA2300-3。利用SmaI、SacI将合成的 SP+mCBD基因序列酶切连接到（连接方法同上）PCAMBIA2300-3获得p2300-pE200-mCBD，构 建如线如图1。
[0034] 实施例2.陆地棉（Gossypiumhirsutum)的遗传转化：
[0035] 利用农杆菌介导的遗传转化方法，用含有mCBD基因的载体转化冀棉14下胚轴。
[0036] 挑取含有p2300-pE200-mCBD载体的农杆菌LBA4404,接种至含卡郝霉素 化anamycin,km) 50mg/L、利福平（rifampicin,rif)50mg/L及链霉素（streptomycin,S/ Sm) 50mg/L的LB液体培养基中，28°C振荡暗培养过夜到细菌生长对数期。W菌液；培养基 1 : 50~1 : 100的比例用LB或Y邸液体培养基稀释菌液，再振荡培养4~化，将菌液稀 释至0D600值0. 8~1.0。
[0037] 转基因受体材料为冀棉14,取生长3~4天的无菌苗下胚轴，切成0. 6~0. 8cm 的段，浸染10~15min，取出下胚轴段，置共培养培养基（MSB+KT0.Img/L巧，4-D0.Img/L)， 22°C~25°C共培养2天。转至愈伤诱导培养基（MSB+KT0.Img/L巧，4-D0.Img/L+Kan50mg/ L)20~30天继代一次，90天后转接至愈伤增殖培养基（MSB+KTO.Img/L巧，4-DO. 05mg/L+Kan50mg/L)，20~30天继代一次，待长出胚性愈伤后，将胚性愈伤继代至萌发培养基 (MSB+KT0.Img/L+Kan50mg/L)，40天左右挑取萌发的绿芽至生根培养基（SH+Kan50mg/L)进 行筛选，进而获得小苗和可嫁接抗性植株。抗性植株经过PCR鉴定后嫁接并移栽，获得aC 系列棉花共67个系182株。
[0038] 实施例3.Tl代转基因材料的筛选鉴定：
[0039] 收获Tl代aC系列棉花41个株系215个单株，对收获的棉花进行衣份测定及纤维 检验，并对结果进一步统计分析，筛选得到转化事件aC20-3。与对照相比，转化事件aC20-3 的棉纤维马克隆值下降23. 2%，比强增加12. 1%，衣份值平均增加8. 4%，长度无明显变 化，具体结果见表1。
[0040] 表1
[0041]
[0042] 实施例4.转基因事件aC20-3拷贝数检测
[0043] 利用Southern杂交技术对转基因事件aC20-3拷贝数进行检测。
[0044] 样品制备；取转化事件aC20-3TO代幼嫩植物组织4.Og左右，提取植物基因组 DNA，具体步骤如下：于液氮中研磨成粉末状。在65C水浴中预热提取缓冲液15ml，将研磨 成均匀粉状后加入提取缓冲液中，振荡混匀，65C水浴45min，期间摇匀2-3次，充分裂解。 加入1/3体积5mol/LKAc上下颠倒混匀，冰浴约2-h3,4°C，12000巧m，离必IOmin;取上清， 加入1/5体积的5%CTABBuffer,上下颠倒充分混匀，65°C水浴约20min;待冷却置窒温 后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24 : 1)抽提3次，室温1200化pm离必5min，如界面浑浊 再抽提一至两次；取上清，加入2/3体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置lOmin，室温， 12000巧m，离必IOmin;弃上清，用70%己醇洗涂沉淀两次。抽干沉淀，加500ul灭菌水溶解； 加 1/10 体积RNase处理DNA样品，37°C30min;加 1/10 体积 3mol/LNaAc(抑5. 2)，2 倍体 积无水己醇混匀，-201：放置10111111，4^，12000巧111，离必5111111，用70%己醇洗涂沉淀两次， 抽干沉淀，加适量dd&0溶解，使用紫外分光光度计测量DNA浓度及纯度，取100~200Ug DNA分别用限制性内切酶EcoRI，HindIII，消化过夜后酒精沉淀，用适量d地2〇溶解后加 入0.8%琼脂糖凝胶中，WIV/cm电压电泳过夜。真空转移至尼龙膜上，紫外交联固定。[0045] 探针制备；W含mCBD基因的质粒为模板，W沈Q IDNo;9和沈Q IDNo; 10为引 物，利用PCR法制备地高锋标记的特异性探针，PCR体系如下：
[0047]PCR程序；94.(TC5min;30cycles;94.(TC30s，53.(TC30s，72.(TC30s;72.(TC5min。
[004引杂交检测；将尼龙膜放入杂交管中，加一定体积的杂交液（10ml/100cm2)，65°C，预 杂交3~4h;95°C变性DIG1油eledp;robe(25ng/ml)10min，迅速置于冰水中冷却IOmin 彻底变；将变性探针迅速加到杂交管化5ml/100cm2membrane)，混匀，65°C杂交过夜（> lOh)。取出尼龙膜，进行洗膜。在室温下，30ml2XSSC/0. 1%SDS振荡洗涂2X5min。在 50°C下，0. 1XSSC/0. 1%SDS振荡洗涂2X15min，将膜转入装有20ml洗涂缓冲液中振荡洗 涂5min。在杂交和严谨洗涂后，将膜置洗涂缓冲液浸润1~5min;20~30ml封闭液中赔育 30min;在IOml抗体液赔育30min;用20~30ml洗涂液洗涂2X15min;15ml检测液中平衡 2~5min;现配20ml显色底物（NBT/BCI巧暗处静置显色；50ml灭菌水或TE洗膜5min终 止显色，拍照保存。检测结果如图2如示，两组单酶切杂交结果表明，转化事件aC20-3中， 目的基因为单拷贝插入。
[0049] 实施例5.旁侧序列分析
[0050] 样品制备：取2. 5UgDNA，分别用StuI消化6~8小时，酒精沉淀纯化后加适量 水溶解。
[0051] 连接接头：设计合成一对接头：
[0052] GenomeWa化er Adaptor+，Gen