一种经化学修饰后的核酸适配体as1411及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种经修饰的核酸适配体（aptamer)AS1411及其用途，特别设及一种 通过利用异核巧或异核巧联合2'-脱氧肌巧对核酸适配体AS1411序列进行化学修饰而得 到的产品及其用途，本发明属于生物医药领域。
【背景技术】 阳00引 Aptamer,即核酸适配体，源于拉下语"ap化S"，是由20-60个碱基组成的单链寡聚 核巧酸（RNA)或单链寡聚脱氧核巧酸值NA)。它能特异结合蛋白、小分子、离子和细胞等多 种祀分子。核酸适配体于1990年由诺贝尔医学奖获得者Szostak和Gold等人发明，其具 有很多抗体难W比拟的优势。核酸适配体是通过SELEX技术筛选得到的，利用该技术可W 从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与祀标高亲和力结合的核酸适配体（Aptamer)。自 Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附隧菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡 核巧酸配基后，经过二十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。
[0003] 理论上，通过沈LEX筛选可W得到针对任何祀标的核酸适配体。利用沈LEX筛选 科学家筛选得到了一系列与人类疾病密切相关的核酸适配体，如针对HIV-I逆转录酶、血 管内皮生长因子（VEGF)、核仁素、凝血酶、hnRNPAl蛋白等的核酸适配体。其中针对核仁素 的核酸适配体AS1411已经完成二期临床实验，其对肾癌和非小细胞肺癌都有明显的治疗 作用，对急性髓性白血病的二期临床试验正在进行当中。因此开展对核酸适配体的研究工 作具有非常重要的意义。
[0004] 目前的核酸适配体绝大多数均是通过SELEX筛选得到。而SELEX过程中的四个重 要步骤：建库、筛选、分离、PCR扩增，对筛选是否成功都具有比较重要的影响。目前通过合 理的设计筛选库和优化分离方法能够大大提高SELEX筛选的成功率。在SELEX筛选中PCR 是比较重要的一个环节。在此环节中W筛选得到的核酸为模板，在DNA聚合酶的作用下进 行扩增。在DNA的合成过程中，由于DNA聚合酶有比较强的选择性，只能识别天然的A、G、 C、T四种核巧酸，所W筛选得到的核酸适配体一般只是A、G、C、T的组合。对于一些理化 性质更好的核巧类似物如UNA、LNA、2' -F-araN等，DNA聚合酶无法将其渗入到核酸适配体 中。运种局限性限制了SELEX的应用。在对目前已经筛选得到的核酸适配体进行UNA、LNA、 2' -F-araN、2' -O-meth^修饰发现，运些经过修饰的核酸适配体在一定程度上可W优化通 过SELEX筛选到的核酸适配体的理化性质或提高核酸适配体的活性。 阳〇化]为了进一步增加核酸适配体与祀标的特异性，优化核酸适配体的理化性质提高核 酸适配体的活性，有必要对核酸适配体进行进一步的优化。而传统的SELEX筛选已经无法 满足此要求。核酸适配体与祀标的识别是一个相互诱导契合的过程。因此在核酸适配体局 部进行一定的微调，能够在保持核酸总体二级结构的前提下增强与祀标的相互作用，提高 核酸适配体的特异性和生物活性。
[0006] 异核巧是指一类碱基由糖基的r位移至其它位置的核巧。类似于天然核糖，根据 糖基构型的不同，异核巧又可分为D-和k两种，其中D-构型与天然核巧类型相同，k构 型则相反。由于异核巧的碱基发生移位，导致异核巧渗入的核酸适配体的局部构象发生改 变。当异核巧渗入的位点为核酸适配体与祀标的作用位点时，碱基空间构象的变化会导致 与祀标的空间距离发生改变，当用两种构型相反的异核巧分别渗入到核酸与祀标的结合位 点时，就会导致一种与祀标的作用距离增加，活性降低，另一种构型异核巧渗入的核酸适配 体与祀标的作用距离缩短，活性增加。因此将异核巧引入到核酸适配体中，通过调整核酸适 配体局部空间构象，可W达到增强与祀标的作用力，进一步提高核酸适配体生物活性的目 的。异核巧的运种修饰策略与SELEX有所不同，SELEX筛选是从众多无序的核酸序列中寻 找到某一条特定的能与祀标特异性结合的核酸，而异核巧修饰策略作用的对象则是对现有 核酸适配体的优化。但它们的目标一致，即通过各种方法得到能与祀标高特异性结合的核 酸适配体。SELEX是一种初期的筛选，异核巧修饰策略是一种后期的优化，异核巧修饰策略 和SELEX筛选方法彼此相互补充和完善了筛选核酸适配体的方法。
[0007] 本发明利用异核巧或异核巧联合2'-脱氧肌巧的修饰策略对核仁素的核酸适配 体AS1411进行化学修饰，寻找到了能进一步提高与祀标亲合力的核酸适配体。通过体外实 验和动物实验也证明经过本发明的化学修饰策略优化后的核酸适配体能够明显提高对祀 标的生物活性。因此，将运种修饰策略进行进一步的推广，将有望对各种不同的核酸适配体 进行优化，从而得到与祀标特异性更强，活性更好的核酸适配体。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种通过利用异核巧或异核巧联合2'-脱氧 肌巧对核酸适配体AS1411序列进行化学修饰后得到的产品及其用途，本发明通过采用异 核巧或异核巧联合2'-脱氧肌巧对核酸适配体进行化学修饰，改变了核酸适配体与祀标结 合部分碱基的空间构象，从而达到了增强核酸适配体与祀标的相互作用，增强核酸适配体 对祀标的特异性，W及提高核酸适配体生物活性的目的。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0010] 本发明的一种经过化学修饰的核酸适配体AS1411，修饰前的核酸适配体AS1411 的序列如SEQIDNo. 1所示，其特征在于，在核酸适配体序列AS1411的一个或多个核巧位 点渗入异核巧，所述异核巧的结构式如化学式I或化学式II所示，化学式I所示的异核巧 为k构型的异核巧，化学式II所示的异核巧为D-构型的异核巧，其中，Base为腺嚷岭A、 胸腺喀晚T、鸟嚷岭G或胞喀晚C，
[0011]
[0012] 用化学式I或化学式II所示的异核巧代替天然核巧在核酸适配体AS1411序列中 的相应位置进行偶联。
[0013] 在本发明中，优选的，在核酸适配体AS1411序列的一个或多个核巧位点渗入异核 巧的同时，还包括在核酸适配体AS1411序列的一个或多个核巧位点渗入2'-脱氧肌巧，所 述的2'-脱氧肌巧的结构式如化学式III所示：
[0014]
[0015] 用化学式I或化学式II所示的异核巧W及化学式III所示的2'-脱氧肌巧代替 天然核巧在核酸适配体AS1411序列中的相应位置进行偶联。
[0016] D/L构型异核巧与天然核巧相比具有如下特点：a.碱基从糖环的r位移到2'位； b.L构型异核巧的糖环发生翻转，局部构象变化相比D构型核巧较大。导致在氨基酸序列不 变的前提下，采用D/L异核巧修饰的核酸适配体与天然的核酸适配体相比构象会发生一定 的变化。当运种修饰位点处于与祀标结合的区域时，则会起到调节与祀标结合的作用。部 分位点渗入异核巧，最终达到提高与祀标的结合力、增强生物活性的目的。2'-脱氧肌巧的 作用与异核巧的作用类似，但它主要通过调整碱基来达到调整局部空间构象的目的。
[0017] 在本发明的具体实施例中，经过化学修饰的核酸适配体AS1411选自W下序列所 组成的群组：
[0018] 1)在SEQIDNo. 1所示的AS1411序列的6位渗入化学式I所示的异核巧代替天 然核巧在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS1411-化)，其中，Base为胸腺喀晚T; 阳019] 2)在SEQIDNo. 1所示的AS1411序列的12位渗入化学式II所示的异核巧代替 天然核巧在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS1411-12D)，其中，Base为胸腺喀晚T;W及
[0020] 3)同时在SEQIDNo. 1所示的AS1411序列的6位和12位分别渗入化学式 I和化学式II所示的异核巧代替天然核巧在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体 (AS1411-化/12D)，其中，Base为胸腺喀晚T;W及 阳02U 4)在SEQIDNo. 1所示的AS1411序列的6位和12位分别渗入化学式I和化学式 II所示的异核巧的同时，在AS1411序列的24位渗入化学式III所示的2'-脱氧肌巧，代 替天然核巧在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS1411-化/12D/24dI)，其中，Base 为胸腺喀晚T。
[0022] WAS411-化为例，W上所述在SE