一种NT-proBNP核酸适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于NT-proBNP检测技术领域，特别涉及一种NT-proBNP核酸适配体及其 应用。
【背景技术】
[0002] 脑钠肽（BNP)最早由Sudoh等在猪脑中发现，是一种由32氨基酸肽链组成的多肽 类神经激素。人类心脏初始分泌的BNP是一种由132个氨基酸组成的前体，其后被酶切降 解为具有生物活性的BNP(32个氨基酸残基组成）及脑钠肽前体N末端（NT-ProBNP，76个 氨基酸残基组成）。BNP和NT-ProBNP主要由心肌壁受压后心室应答释放，是对心功能敏感 且特异的标志物，其在血液中的浓度与心功能障碍的严重程度相关，可以用来更客观的评 价患者疾病的严重程度和患者的预后。广泛应用于心衰诊断、心衰预后与监视的评估、急性 冠脉综合症的危险分类、早期或轻度的心功能不全等。
[0003] NT-ProBNP较BNP在评价心功能上更具有优势，其优势在于：l、NT-proBNP由76个 氨基酸组成，较BNP半衰期长，其半衰期大于lh，在血液中清除较慢，可累积较高浓度，更能 灵敏地反映心功能的状态和变化，尤其是在早期诊断中；标本可以存放，即可以中心实验室 检测，也可以床边检测，BNP只能床边即刻检测；2、由于无生理活性，因而不受治疗用合成 BNP的干扰；3、NT-proBNP可以使用血清和血浆，抗干扰性强，BNP只能使用血浆标本。4、 NT-proBNP的定量结果能提供可靠，且具有良好的重复性临床信息，更适合临床应用。因此， 目前临床应用中已逐渐呈现将NT-proBNP取代BNP的趋势。
[0004] 目前NT-proBNP检测方法主要为免疫检测方法，一种为竞争酶联免疫分析，如 Biomedica Gruppe公司的产品；一种为双抗体夹心法，如Roche Diagnostics的双抗体夹 心化学发光法，已申报发明专利。目前，基于抗体的方法，有一定优势，但也有一些固有的缺 陷。现在，科学家不约而同的把注意力聚焦到分子生物学新技术在生物检测的应用上。
[0005]SELEX技术（系统进化指数富集技术）是90年代初研制的一种新的组合化学技 术。其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随 机序列一般长度在20-40bp左右，文库容量在1014-1015之间。由于单链随机寡核苷酸片段 特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四联体等二级结构，故能与蛋白质、小肽，甚至金属 离子结合，形成具有很强结合力的复合物。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组 合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的核 酸适体具有许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小可以化学合成，节约成本；b.具有比 抗体更高的特异性和相近的亲和性；c.便于标记，在不同部位有选择性的标记；d.稳定性 好，重复性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配体在临床检测及诊 断中具有良好的应用前景。有关核酸适配体检测新技术已广泛应用生物检测、生物传感、体 内成像、蛋白核酸功能研究各个领域，显示出了诱人的前景。
[0006] NT-proBNP为76氨基酸残基的多肽，分子量小，可利用的抗原表位局限，且被罗氏 专利保护，核酸适配体分子量只有10-20KD，较抗体IgG150kD小得多，在建立夹心法的检测 中，可以获得多个抗原位点的特异核酸适配体，可以克服抗体分子量大而引起空间位阻的 影响，易于夹心检测方法的建立。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术中的不足，其目的在于提供一种NT-proBNP核酸适配体及其 应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下；
[0009] 一种NT-proBNP核酸适配体，所述的核酸适配体为SEQ ID : 1-15所示的核苷酸序 列中的任意一条。
[0010] 所述的核酸适配体能与NT-proBNP蛋白或NT-proBNP蛋白N端氨基酸序列制备的 单克隆抗体相结合。
[0011]所述的NT-proBNP蛋白N端的氨基酸序列为GlySerAlaSerAspLeuGluThr SerGlyLeuGlnGluGlnArg。
[0012] 一种NT-proBNP核酸适配体在制备NT-proBNP检测试剂盒中的应用。
[0013] 所述的NT-proBNP核酸适配体被生物素标记。
[0014] 一种NT-proBNP核酸适配体在制备NT-proBNP检测试纸条中的应用。
[0015] 所述的NT-proBNP核酸适配体被胶体金标记。
[0016] 所述的NT-proBNP检测试纸条的组成为：在PVC背衬（1)上依次粘附有样品垫 (2)、结合垫（3)、硝酸纤维素膜（4)和吸水垫（5);所述的结合垫（3)上包被有由胶体金标 记的NT-proBNP核酸适配体；所述的硝酸纤维素膜设置有检测线（6)和质控线（7);其中， 检测线（6)上包被有NT-proBNP蛋白N端氨基酸的单克隆抗体，质控线（7)上包被有与胶 体金标记的NT-proBNP的核酸适配体结合的试剂。
[0017] 所述的与胶体金标记的NT-proBNP的核酸适配体结合的试剂为NT-proBNP核酸适 配体的互补序列。
[0018] 本发明的优点为：所述的NT-proBNP核酸适配体本身是寡核苷酸，分子量较小， 可以化学合成，节约成本，具有比抗体更高的亲和性和特异性；同时所述的NT-proBNP核 酸适配体便于标记，重复性和稳定性好，易于保存。用所述NT-proBNP核酸适配体制备的 NT-proBNP检测试剂盒和试纸条对NT-proBNP检测灵敏，且易于优化。
【附图说明】
[0019] 图1为合成的NT-proBNP基因与proBNP基因序列的测序比对图。
[0020] 图2为pGEX4T-1-NT-ProBNP表达载体的双酶切电泳图。
[0021] 图3为纯化后的GST-NT-proBNP蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，1 :诱导前全菌，2 : 诱导沉淀，3 :诱导上清，4 :GST柱纯化穿透液，5-9 :GST纯化洗脱收集液，10 :蛋白分子量标 准。
[0022] 图4为纯化后的12G4单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图。
[0023] 图5为阳性克隆PCR鉴定电泳图。
[0024] 图6为NT-proBNP核酸适配体活性评价柱形图。
[0025] 图7为一种NT-proBNP检测试纸条的结构示意图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
[0027] 实施例1 :全基因合成NT-proBNP基因，构建pGEX4T-l-NT-ProBNP表达载体并纯 化GST-NT-proBNP蛋白。
[0028] (1)通过genebank查询proBNP基因序列，根据成熟BNP后剪切的N端序列即 NT-proBNP序列设计全序列合成方案，通过DNAwork2. 0软件进行密码子优化，不改变氨基 酸序列组成，并使蛋白更易于在原核大肠杆菌中表达，然后在优化后的核酸序列的两端加 上EcoRI和SalI酶切位点，便于与表达载体连接克隆，优化设计后的核苷酸序列如SEQ ID:16所示。将优化后的序列送交金斯瑞公司进行合成，图1为合成的NT-proBNP基因与 proBNP基因序列的测序比对图。
[0029] (2)将合成基因NT-proBNP从PUC57载体中双酶切后胶回收，并将pGex4T-l 载体双酶切，回收载体片段，将回收基因片段和载体片段经T4DNA连接酶连接，构建成 pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP表达载体，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂平板，37度培养 16h，挑取单克隆进行液体培养并提取质粒进行双酶切鉴定。图2为pGEX4T-l-NT-Pr〇BNP 表达载体的双酶切电泳图，从图可知表达载体构建成功。
[0030] (3)将构建好的pGEX4T-1-NT-ProBNP表达载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态 细胞中，挑取单克隆进行IPTG诱导表达，挑选表达量高的单克隆保存作为菌种。放大菌种 培养，进行诱导后收集菌体，超声破碎，采用GST标签亲和柱进行亲和纯化，收集洗脱峰进 行SDS-PAGE电泳分析，如图3所示。纯化的GST-NT-proBNP蛋白纯度达95%以上，可以满 足接下来的实验需求。
[0031] 实施例2 :制备NT-proBNP蛋白N端氨基酸的单克隆抗体。
[0032] 分析NT-proBNP蛋白的抗原表位，选择N端优势抗原表位，人共合成NT-proBNP蛋 白的N端 15 个氨基酸多肽(GlySerAlaSerAspLeuGluThrSerGlyLeuGlnGluGlnArg)，将合成 的多肽与牛血清白蛋白（BSA)共价偶联后进行免疫，当血清效价达到要求后，进行脾细胞 分离，并与SP/20骨髓瘤细胞融合，进行单细胞克隆，将抗体效价高的单细胞克隆进行亚克 隆，如表1所示：5G4、5E7和12G4单克隆抗体活性较高，将此3株活性较高的单克隆抗体制 备腹水，并用proteinA亲和层析进行纯化。图4为纯化后的12G4单克隆抗体的SDS-PAGE 电泳图，显示为重链、轻链两条带。
[0033] 表1 :单克隆抗体的筛选（0D450nm吸光度）
[0034]
[0035] 实施例3:筛选与获得的单克隆抗体配对的NT-proBNP核酸适配体。
[0036] 筛选步骤如下：
[0037] 1、硅包磁珠经APTES(2% )氨基硅烷化处理，使其带活性氨基，形成氨基磁珠；
[0038]2、将 8ug/ml的NT-proBNP单克隆抗体（5G4)，在 37°C下经EDC/NHS(4mg/ml/llmg/ ml)活化羧基，活化时间为15min;然后取lml活化后的单克隆抗体与lmg氨基磁珠在37°C 下偶联lh，形成偶联抗体磁珠；
[0039] 3、用PBS清洗偶联抗体磁珠5次，然后用1 %BSA封闭过夜；
[0040] 4、加入100ul(2mg/ml)的GST-NT-proBNP蛋白到lml的偶联抗体磁珠中，孵育2h， 形成结合GST-NT-proBNP蛋白的偶联抗体磁珠；
[0041] 5、用SHMCK(0. 2%Tween-20)洗 5 次；
[0042] 6、将人工合成的ssDNA文