一种基于单链dna核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学分析测试仪器领域，涉及到基于核酸适配体修饰的有机/无机杂化毛细管整体柱，及一种新型管内固相微萃取整体柱制备方法，该整体柱适用于复杂食品和生物样品中痕量、超痕量赭曲霉毒素等组分的快速、高效、高选择性分离富集。
【背景技术】
[0002]由于待测组分受其共存组分的干扰或者由于测定方法本身灵敏度的限制以及对待测组分状态的要求，绝大多数化学检测和分析方法要求事先对试样进行有效的、合理的处理，即在进行分析测定前应对试样进行物理或者化学的处理，将待测组分从样品中提取出来，排除其它组分对待测组分的干扰。简单、快速、高效、绿色、高选择性、自动化的样品前处理技术是分析复杂样品如血浆、尿液、医药、环境样品和食品中痕量或超痕量待测组分的重要步骤。传统样品前处理技术包括液-液萃取、沉淀分离、离子交换萃取、柱色谱等，相对于仪器分析技术的发展，样品前处理技术的进展较为缓慢，普遍存在耗时、低效、有机溶剂用量大、操作较繁琐、选择性差等问题，导致样品前处理成为整个分析过程中最费时费力的环节，同时在样品分析过程中至少导致了三分之一的误差产生。
[0003]固相微萃取(Solid-phasemicroextract1n, SPME)技术由 Belardi 与 Pawliszyn在1989年提出，由于集采样、萃取、浓缩及进样于一体，具有耗时少、操作简单、效率高、无溶剂或少溶剂、易与色谱仪器联用等优点，提高了分析速度及灵敏度，已在环境、生物、工业、食品、临床医学等领域的各个方面得到广泛的应用。然而，传统的固相微萃取头存在易折断、萃取量不足等缺点，不利于与高效液相色谱的在线联用。管内固相微萃取(In-tubeSolid-phase microextract1n, In-tube SPME)能较好地克服以上问题，易与其它仪器实现在线联用。为此，国内外众多研究小组开发了各种形式的管内固相微萃取，主要有以下三种形式:开管柱、颗粒/纤维填充柱、整体柱。近年来，具有选择性高、稳定性好、制备简单等整体柱成为管内固相微萃取的研究热点。毛细管整体柱克服了开管柱存在的不足，同时也避免了颗粒填充柱操作繁琐的特点，具有制备简单、渗透性好、传质效率高等特点。整体柱材料中，分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer, MIP)由于其类似于“钥匙-锁”相互作用的识别原理，成为选择性整体柱材料研究的主要研究对象。但由于分子印迹技术自身的特点，尚存在合成时材料消耗大、极性溶剂干扰、刚性识别“空穴”易被破坏或变形等不足，以及MIP合成过程中不可避免地产生非特异性结合位点，导致其选择性与抗体-抗原、酶-底物等专一特异性生物识别体系相比存在较大差距，上述问题限制了其在生物样品分析中的应用前景。因此，对于复杂生物样品中痕量、超痕量组分分析而言，寻找水溶液样品适用性好、选择性更强的管内固相微萃取材料是解决问题的关键，而生物识别体系无疑是较好的选择。
[0004]核酸适配体是经体外筛选技术-指数富集的配基系统进化技术(Systematicevolut1n of ligands by exponential enrichment, SELEX)从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合目标配体的单链寡核苷酸序列(DNA或RNA)，具有高度专一性，一般是由几十个核苷酸组成，目前已发展成为一种广受关注的新型识别分子。核酸适配体作为一种人工合成的核酸，具有稳定的二级结构和高特异性、高亲和力、便于化学修饰与功能化的特点。基于核酸适配体的各种结构特点，无机离子、有机分子、生物大分子蛋白质、酶等乃至细胞、微生物均可能存在与其对应的高特异性适配体，适配体一靶目标复合物的解离常数通常在μπιο?到nmol范围内，有的甚至达到pmol。目前适配体的应用主要包括在化学研究检测系统中作为分子识别元件，在生物样品分离富集过程中作为能够与靶目标发生特异性结合的配基以及在医学上用于临床诊断和治疗。例如，Chris Le等将适配体固定在毛细管色谱整体柱中，用于蛋白质混合物中细胞色素C的分离与检测。Jiang等成功利用SELEX技术筛选获得葡萄球菌肠毒素B (SEB)高亲和力的ssDNA适配体，并发现SEB与葡萄球菌A蛋白和牛血清清蛋白无非特异性的结合，为其诊断与治疗奠定了基础。2008年，Shamah等研究了复合靶(即靶分子的混合物)SELEX技术筛选。Jenison等从RNA库中分离得到茶碱适配体，与茶碱的亲和力比咖啡因高10000倍以上。
[0005]近年来，国内外研究者已将焦点移至核酸适配体在分析化学领域的应用。适配体易修饰的特性能使其作为配基可固定在各种材料表面，如硅胶、金属、磁性微球、量子点等，应用于各类分离技术，包括液相色谱、亲和色谱、毛细管电泳、毛细管电色谱、生物传感器及原子力显微镜等。例如，Oznur等通过固载后的核酸适配体6H7和6H5实现了 His — tagged蛋白质的分离纯化；Wu等通过将氨基修饰的核酸适配体化学键合到羧基化的磁性微球上，用于分离、富集小麦中生物毒素；zhao等将凝血酶适配体修饰在聚合物整体柱上，对人体血液及尿液中实现了凝血酶的分离、检测。
【发明内容】
[0006]本发明针对前文所述的SPME易折断、萃取量不足、选择性不高及生物样品兼容性较差等问题，将核酸适配体亲合力高、特异性强、生物样品相容性好等特性与In-tube SPME技术效率高、易与仪器联用、操作简单等优点结合在一起，制备有机/无机杂化毛细管整体柱，通过链霉亲和素与生物素之间高亲和力将核酸适配体固定毛细管整体柱内，研制一种基于核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱新型管内SPME萃取柱，用于复杂生物样品及食品中痕量、超痕量的赭曲霉素、黄曲霉素等物质的高选择性分离与富集。
[0007]本发明通过以下技术方案实现:一种基于单链DNA核酸适配体修饰有机/无机杂化石英毛细管整体柱的制备方法，按以下步骤依次进行:
[0008](I)采用食人鱼碱溶液，循环流动方式，对空心石英毛细管内表面进行活化处理；该食人魚碱溶液的配制为30% H202-70% H2SO4(1:4, v: v)，取足量的食人鱼碱溶液，循环流经石英毛细管，置于60°C反应3h，用无水乙醇和水冲洗；
[0009](2)称CTAB于离心管中，分别加入TE0S、APTES、无水乙醇及水，于旋涡混合器上高速涡旋，得CTAB的混匀液，采用注射栗将所述混匀液注入所述步骤(I)处理后的空心石英毛细管中，硅胶片封端，水浴锅恒温反应，取出所述空心石英毛细管，置于烘箱中干燥老化，制备得到有机/无机杂化整体柱；
[0010](3)采用高压液相栗，先后用甲醇和纯净水冲洗所述步骤(2)所得的有机/无机杂化整体柱，分别冲洗一定时间，除去剩余的CTAB ；[0011 ] ⑷Na2CO3缓冲液(pH = 9.0)配制lmg/L SA溶液为，取SA溶液于试剂瓶中，加入EDC与NHS的混合液及PBS缓冲液，混匀后静置活化，注射栗注入步骤(3)处理后的整体柱，室温反应一段时间，采用PBS缓冲液反复冲洗；
[0012](5)采用Tris-HCl缓冲液配制赭曲霉素A适配体溶液，将所述赭曲霉素A适配体溶液通过注射栗注入所述步骤(4)处理后的有机/无机杂化整体柱，室温下循环反应，用Tris-HCl缓冲液反复冲洗，除去剩余的赭曲霉素A适配体溶液，将被所述Tris-HCl缓冲液冲洗后的有机/无机杂化整体柱于低温保存，既得。
[0013]具体来说，有机/无机杂化整体柱制备的优选方案如下，所述步骤(2)和步骤(3)具体地为，在室温下将适量CTAB于离心管中，分别加入TEOS、APTES、无水乙醇及水涡旋混匀，注入步骤(I)处理后的石英毛细管内，40°C水浴反应24h，分别用甲醇和水经高压栗冲洗；
[0014]进一步来说，针对内径为0.53_、长度为15cm的空心熔融石英毛细管，其反应试剂具体用量为 112 μ L TE0S, 118 μ L APTES，8mg CTAB，215 μ L 的无水乙醇和 25 μ L/K。
[0015]具体来说，生物素标记的赭曲霉素A核酸适配体固载到有机/无机杂化整体柱内，首先将适量SA在弱酸性条件下通过氨基和羧基发生的酰胺反应偶联在整体柱内，然后应用生物素与链霉亲和素之间的高亲和力作用系统，在适配体缓冲液Tris-HCl中，将赭曲霉素A适配体修饰在有机/无机杂化整体柱内。
[0016]进一步来说，所采用的SA偶联条件:200 μ L链霉亲和素溶液，pH为6.5的1mmol/L PBS 缓冲液(0.lmol/L NaCl、10mmol/L Na2HP04/NaH2P04、5mmol/L MgCl2)及 EDC/NHS 比例为1:4的混合液；适配体固载条件:1400 μ L赭曲霉素A适配体溶液，50mmol/L Tris-HCl缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、120mmol/L NaCl、20mmol/L MgCl2、5mmol/L KCU pH = 7.4)，适配体固载时间为24h，核酸适配体键合缓冲液为50mmol/L Tris缓冲液，核酸适配体溶液浓度为 0.205 μ mol/Lo
[0017]需要说明一下的是，文中所述CTAB为十六烷基三甲基溴化铵的简称；所述TEOS为正硅酸乙酯的简称；所述APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷的简称；所述SA溶液为链霉亲和素溶液的简称；所述EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的简称；所述NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的简称；所述PBS缓冲液为磷酸缓冲液的简称，所述赭曲霉素A适配体溶液为Tris-HCl缓冲液配制的赭曲霉素A核酸适配体溶液。