一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对核酸等温扩增及检测技术，属于核酸检测领域。更具体的，涉及在切 刻内切酶和聚合酶的联合作用下，应用两条扩增引物和一条置换引物在等温条件下高效特 异性扩增目标核酸的方法。
[0002] 本发明还涉及了对致病微生物核酸检测方面的应用。
【背景技术】
[0003] 近几十年来，随着聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)发明应用， 极大的推动了双链核酸体外扩增和体外检测等领域的发展。因其高的灵敏度和较好的特异 性从而在核酸扩增及分子检测领域得到广泛应用，是目前最常用的核酸扩增检测技术。该 技术包括三个经典的步骤：即1)高温变性；2)低温复性；3)适温延伸。很明显，该技术是 一个温度变化循环的的过程，需要特定的热循环仪实现精密的温度控制需要。同时，在温度 变化过程中，反应体系可能会暴露于易于发生非特异性扩增的温度下，这是PCR及其衍生 技术中，非特异性扩增产生的重要诱因之一。同时，人们认为复性的特异性直接影响扩增的 特异性，因此，该技术通常需要优化复性温度以提高特异性，工作较为繁琐复杂。并且由于 该类技术反应一般需要较长时间，满足不了即时检测领域对快速的要求。
[0004] 为克服以PCR技术为代表的核酸变温扩增技术的诸多弊端，人们开发了一系列 等温扩增技术。其中，环介导等温扩增技术（Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP)是目前最为广泛应用的等温扩增技术。该技术是2000年日本学者Notomi等建立 的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，它由四条特异性引物识别双链靶标的六个区 域，通过引物的延伸置换以及自身的碱基互补配对形成类似哑铃状的DNA结构，LAMP反应 以此结构为起始结构，进行生长扩增和再循环，使得靶序列交替重复产生，最终形成具有很 多环的花椰菜状的结构。LAMP技术的灵敏性和特异性都很高，并且反应一般可在20~60 分钟内完成，速度较快。但是该技术所用引物众多，设计复杂，需要专门的设计软件；尽管该 技术的扩增是在等温条件下进行的，但是双链靶标仍需要初始变性的步骤。
[0005] 依赖解旋酶恒温扩增技术（Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification, HDA)是New England Biolabs公司的研究人员模拟体内DNA的复制机制发 明的一种新的体外恒温核酸扩增技术。该技术采用解旋酶打开双链核酸，代替了 PCR技术 中采用热变性解链的方式，使得反应可以在等温条件下进行。但是该反应需要额外添加单 链DNA结合蛋白（Single-stranded DNA-binding protein, SSB)增加了反应体系的复杂程 度。
[0006] 链置换扩增（Strand Displacement Amplification, SDA)也是一种有效的扩增检 测双链核酸的方法，由沃克（Walker)等人于1992年开发。该技术使用两组引物（两条 扩增引物和两条置换引物）、限制性内切酶和具有链置换能力的DNA聚合酶以及修饰的碱 基。置换引物置换首先延长的扩增引物产生下一步反应的单链。扩增引物与此单链互补 并延伸，扩增引物中含有内切酶的识别位点，在采用硫代的特定碱基，使得内切酶仅能切割 双链中的一条链产生切口，聚合酶在切口处合成新的链并将原先的链置换下来同时补平 酶切位点，被置换的链又与扩增引物互补而开启循环扩增。该技术在专利US5270184A和 US5455166A中有详细介绍。BD公司（Becton, Dickinson and Company)应用该技术已经开 发出一系列分子诊断产品。但是该技术需要四条引物的参与，体系复杂容易引起非特异性 反应的发生，仍需要初始热变性的步骤，并且必须有修饰的碱基参与，增加了实验成本降低 了反应效率。随着一系列切刻内切酶被开发出来，内切酶加修饰碱基所起的作用被切刻内 切酶所代替，采用切刻酶和聚合酶的联合作用从双链核酸靶标上扩增出单链靶标，然后采 用四条引物引发指数扩增。该过程在美国公开的专利US2008096257A1和US2009092967A1 有详细介绍。但是该种技术方案容易引起非特异性反应的四条引物设计及反应效率等问题 依然存在，所述的方法中，存在置换引物B2较扩增引物P2先延伸的可能性，这实质上相当 于占据了扩增引物P2的模板阻滞了其与模板的退火和延伸的效率，增加反应体系的复杂 性，降低了扩增效率。
[0007] 为了改善专利US2008096257A1和US2009092967A1所述技术存在的缺点，比如反 应体系复杂容易引起非特异性扩增，置换引物占据模板阻滞扩增降低扩增效率等问题，本 发明提供了一种简便高效的核酸等温扩增检测方法，该方法仅用三条引物就可实现靶标核 酸的高效特异扩增，体系简单；扩增引物P2与单链模板退火区域紧邻切点的设计使得反应 具有更好的特异性，并且模板的3'端与该引物完全互补，使得扩增出的模板可以被引物高 效利用，反应效率更高；可依据反应温度选用不同的切刻内切酶，适用温度范围广，符合现 场快速检测的需求。
【发明内容】
[0008] 本发明将切刻内切酶聚合酶联合作用于待检靶标核酸，在等温条件下下实现靶标 核酸的快速扩增。
[0009] -种在等温条件下扩增检测双链核酸靶标的方法，所述方法包括：
[0010] a)保温双链核酸靶标、切刻内切酶和聚合酶、两条扩增引物和一条置换引物、以及 扩增反应所必须的物质如dNTPs和缓冲液等。保温时间可为任意时间，但为了较好的反应 效率及特异性，优选时间为优选30分钟到1小时。
[0011] b)切刻内切酶识别双链核酸靶标上其识别位点，在切刻内切酶和聚合酶的共同作 用下循环产生单链或者5'端游离的悬垂片段，下述均称为单链靶标；
[0012] C)扩增引物Pl和置换引物Bl先后与步骤b)中所述单链靶标退火，并在聚合酶 的作用下进行合成和链置换合成，产生游离的由扩增引物Pl延伸形成的产物，称为单链模 板，称之为单链模板；
[0013] d)扩增引物P2与c)中单链模板退火，两者在聚合酶或者切刻内切酶与聚合酶的 共同作用下互相以对方为模板延伸成为完整的双链核酸分子，称为双链模板。需要注意到， 本步骤中扩增引物P2与单链模板的3'端退火后聚合酶能以单链模板3'端为起点合成DNA。 并且此步骤中扩增引物P2除通常意义上的线状分子外，还包括分子信标的形式。
[0014] e)切刻内切酶和聚合酶联合作用于步骤d)中产生的双链模板，循环扩增出可与 扩增引物Pl或P2互补的单链。该单链与扩增引物Pl或P2退火，并在聚合酶或者聚合酶 与切刻内切酶的共同作用下延伸成为双链核酸分子。
[0015] f)切刻内切酶聚合酶联合作用于步骤e)中产生的双链核酸分子，循环扩增循环 扩增出可与扩增引物P2或Pl互补的单链。该单链与扩增引物Pl或P2退火后又产生步骤 e)所述的双链核酸分子。
[0016] g)重复步骤e)和步骤f)，以指数形式产生核酸分子。
[0017] 所述扩增引物PU扩增引物P2和置换引物Bl其特征如下：
[0018] a)扩增引物Pl可为线状或茎环状分子，按照3'到5'的顺序可以分为：3'端与模 板退火区域、切刻内切酶识别序列区域、以及5'端稳定序列区域。需要注意到，当扩增引物 Pl为茎环状分子时，所述切刻内切酶识别序列区域和5'端稳定序列区域应当包含形成茎 环茎环结构的茎区和环区；本领域的研究人员应当明白如何分配上述碱基区域以得到预期 的效果；
[0019] b)扩增引物P2可为线状、茎环状或分子信标形式，可将其分为与单链模板退火区 域、切刻内切酶识别序列区域以及稳定序列区域四个部分。根据扩增引物P2的形状不同确 定上述各部分的组成，本领域的研究人员应当明白如何合理的进行各区域碱基的分配以达 到预期的实验效果；
[0020] c)所述稳定序列区域，是指当切刻内切酶产生切口后，位于切口上游的碱基序列。 该部分的作用是为聚合酶提供可以结合的3'端，因此，切刻反应后该上游碱基在反应温 度不会解离，为保证切刻内切酶产生切口后5'端稳定区域仍然以双链形式存在，该区域的 Tm (解链温度）值应不低于反应温度。考虑到增加该区域碱基个数虽可增加 Tm值，但会增 加链的复杂程度，故优选的，该区域Tm值比反应温度稍高可以达到更佳效果，因此需要根 据反应温度确定该区域碱基个数。
[0021] d)同样的，根据反应温度确定扩增引物Pl和P2的3'端退火区域碱基个数，该退 火区域的Tm比反应温度高可达到更好效果。优选的，该区域的Tm值比反应温度高3~5°C。 为保证扩增引物Pl较置换引物Bl先延伸，置换引物Bl的Tm值低于扩增引物Pl的3'端 退火区域的Tm值可使反应更加高效。优选的，置换引物Bl的Tm值比反应温度低2~：TC。
[0022] 同样的，为进一步提高扩增引物Pl利用效率，调控扩增引物Pl与置换引物Bl的 用量比例。
[0023] 两扩增引物切刻内切酶识别序列可不同，也可与双链靶标不同，即体系可采用三 种不同的切刻内切酶。但是优选的，保持上述三处识别序列相同，即仅采用一种切刻内切 酶。
[0024] 优化地，所述等温条件下对靶标核酸扩增检测的方法，所述核酸模板为DNA或 RNA。
[0025] 加入核酸检测试剂可表征系统的信号变化。优化地，核酸检测试剂包括包括荧光 检测试剂、电化学检测试剂、化学发光检测试剂、比色检测试剂等。
[0026] 所述的荧光检测试剂一般包括