一种纸基灵敏检测miRNA的方法与流程

本专利公开了一种纸基灵敏检测mirna的方法，涉及手绘纸电极方法和手动制作纸金电极方法和电化学检测技术领域，即在一张纸上利用蜡笔和铅笔通过手绘技术制作手绘纸电极再通过化学生长法，生长金纳米金，制作纸芯片，更确切的说采用特异性双链核酸酶（duplexspecificnuclease，dsn）在纸芯片上构建了mirna的信号放大机制，即目标mirna与亚甲基蓝标签标记巯基修饰的dna发夹探针sh-cp-21在纸芯片上形成dna/rna的杂交核酸双链，随后dsn切割rna/dna双链体的氧化还原标记的发夹探针，切割后带有标记发夹探针又会与目标mirna杂交导致rna/dna双链体的形成，照此循环，再通过电化学方法检测。

背景技术：

随着现在生活节奏的加快，不健康的饮食和无规律的作息时间等一系列坏习惯导致了人类患上了不同的疾病。癌症已经成为威胁人类健康的一大杀手，近年来其发病率及死亡率更是呈现逐步走高的趋势。研究发现，mirna与癌症密切相关，可以作为癌症早期的检测标志物。它广泛存在于各种体液里，包括唾液、血浆、精液、眼泪和尿液等。而且癌症的发生与多种mirna的变化密切相关，用单一mirna的变化来说明癌症的发生存在很大的局限性。由几个mirna同时变化造成，以mirna等为代表的基因分析已成为临床诊断的理想生物标记。

mirna是一类具有调节功能的非编码rna，它通过调节信使rna影响蛋白质的表达，长约为20-25个核苷酸。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirna也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirna的组合来精细调控某个基因的表达。所以mirna与癌症密切相关，可以作为癌症早期的检测标志物。

由于癌症的发生与多种mirna的变化密切相关，用单一mirna的变化来说明癌症的发生存在很大的局限性，而且体液中mirna含量极低。所以同时检测多种mirna和在mirna含量很低时就能有效快速地检测出变得尤为重要。但是到目前为止，这个过程仍需要通过昂贵的实验室工作，使用显微镜和电脑芯片来实现，而且检测灵敏性低，这在很多经济不发达地区是不可能实现的，因此发明一种既能检测到低浓度又能降低mirna检测成本的方法具有重要意义。一方面，dsn通过循环切割修饰在纸芯片上的目标mirna与发夹探针形成dna/rna的杂交双链中的发夹探针，释放出目标mirna，然后目标mirna又会返回到下一轮反应，继续与有标记的发夹探针结合，dsn又会切割目标mirna与发夹探针形成dna/rna的杂交双链中的有标记的发夹探针，照此，dsn通过多次循环切割修饰在纸芯片上的目标mirna与发夹探针形成dna/rna的杂交双链中的有标记的发夹探针，发夹探针被dsn酶裂解成成千上万的探针分子从而使信号放大。解决高成本、灵敏性检测低问题。另一方面，电化学方法（方波伏安法）检测信号具有响应速度快、仪器成本低、检测灵敏度高等优势也可以很好地解决上述问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是昂贵的实验室工作和使用显微镜和电脑芯片来实现检测，而且检测灵敏性低。

一种纸基灵敏检测mirna的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）制备所需要的试剂

焦炭酸二乙酯处理水成分是1l无菌水、1000µl焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30min得到；生长溶液是由667µl质量分数为1%的氯金酸、1000µl焦炭酸二乙酯处理水、0.0139g盐酸羟胺组成；400ml探针dna缓冲溶液成分是1.0412g4-羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节ph到7得到；

（2）纳米金修饰纸芯片

将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；

（3）巯基和纳米金形成金-硫键

纸芯片上滴加5µl10nm用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的dna发夹探针sh-cp-21，在黑暗环境下室温放置2h，然后用20µl一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（4）巯基乙醇的表面阻挡

纸芯片上滴加8µl巯基己醇自然晾干，最后用20µl一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（5）放大和复用过程

取一定量的50fm目标分子mirna-21、特异性双链核酸酶和特异性双链核酸酶缓冲液，使总体积为7µl，搅拌离心混匀后滴加至纸芯片工作区域，孵育2h；

（6）检测过程

将纸芯片置于适量探针dna缓冲溶液中，用方波伏安法检测；方波伏安法检测的实验参数如下：初始电压为-0.5v、终止电压为0.5v、电位增量为0.004v、振幅为0.025v、频率为25赫兹、静置时间为2s。

本发明的有益效果

（1）可实现个性化基因诊断和疾病精准预防；

（2）可以在飞摩尔范围内直接检测mirna，比传统的杂交试验的灵敏度高五个数量级；

（3）由于纸的内部立体结构，其内部纤维纵横交错，生长的金纳米可以从上到下布满整条纸纤维，这样可以大大地增加比表面积，同时能够改善其导电性及生物相容性，进而大大提高电极的性能。纸纤维的网状多孔结构和大的比表面积，为mirna双特异性酶信号放大提供了广阔的空间和平台，更有利于双链特异性核酸酶的信号放大；

（4）本发明所述方法检测成本低、灵敏度高、时间短、检测便捷。

附图说明

图1为本文所述方法的实验原理图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。

实施例1

一种纸基灵敏检测mirna的方法，其特征是包括以下步骤：

（1）制备所需要的试剂

焦炭酸二乙酯处理水成分是1l无菌水、1000µl焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30min得到；生长溶液是由667µl质量分数为1%的氯金酸、1000µl焦炭酸二乙酯处理水、0.0139g盐酸羟胺组成；400ml探针dna缓冲溶液成分是1.0412g4-羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5g高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节ph到7得到；

（2）纳米金修饰纸芯片

将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；

（3）巯基和纳米金形成金-硫键

纸芯片上滴加5µl10nm用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的dna发夹探针sh-cp-21，在黑暗环境下室温放置2h，然后用20µl一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（4）巯基乙醇的表面阻挡

纸芯片上滴加8µl巯基己醇自然晾干，最后用20µl一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；

（5）放大和复用过程

取一定量的50fm目标分子mirna-21、特异性双链核酸酶和特异性双链核酸酶缓冲液，使总体积为7µl，搅拌离心混匀后滴加至纸芯片工作区域，孵育2h；

（6）检测过程

将纸芯片置于适量探针dna缓冲溶液中，用方波伏安法检测；方波伏安法检测的实验参数如下：初始电压为-0.5v、终止电压为0.5v、电位增量为0.004v、振幅为0.025v、频率为25赫兹、静置时间为2s、灵敏度为10^-6a/v。

实施例2

检测步骤同例1，不同之处是：步骤（6）中检测参数灵敏度为10^-5a/v。

sequencelisting

<110>济南大学

<120>一种纸基灵敏检测mirna的方法

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<213>人工合成

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