专利名称：miRNA检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种miRNA及其前体RNA的检测方法及检测试剂盒，本方法可用于miRNA及其前体的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
背景技术：
miRNA(microRNA)是一类具有19～25nt的RNA分子，是由其前体分子在酶的作用下加工生成，其前体序列一般为70～120nt，广泛存在于生物体中。由于miRNA序列在不同的生物中具有一定的保守性，目前普遍认为miRNA的功能是参与生命的一些基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等，越来越多的证据表明miRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现miRNA与细胞的癌变有着极为密切的关系，已经发现miRNA与肺癌、结直肠肿瘤、伯基特淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关，分析结果显示约一半已发现的miRNA定位于染色体肿瘤基因相关区域及染色体的脆性位点。这些研究结果都表明miRNA在细胞癌变中可能发挥着重要的作用。因此，建立一种快速、简便、费用低的检测方法对miRNA的功能研究和临床检测具有重要意义。
由于miRNA分子只有20nt左右大小，检测比较困难。目前采用的方法主要是Northern blot等杂交的方法进行检测，方法繁琐，不易成功。Allawi等建立了Invader Assay的方法(Allawi HT，Deahlberg JE，OlsonS，et al.Quantitation of microRNAs using a modified Invader assay.RNA，2004，101153-1161)，Liu等建立了寡核苷酸芯片方法(Liu C，Calin GA，et al.An oligonucleotide microchip for genome-widemicroRNA profiling in human and mouse tissues.PNAS，2004，101(26)9740-9744)，需要荧光标记和荧光仪或芯片检测仪，而且由于miRNA分子太小，应用也受到一定的限制。对miRNA前体的检测主要是采用RT-PCR的方法(Schmittgen TD，Jiang J，Liu Q，et al.A high-throughput method to monitor theexpression of microRNA precursors.Nucleic Acids Research，2004，32(4)e43)，采用随机引物或与miRNA前体互补的引物直接进行反转录，但是该方法不适用于miRNA分子的检测。
发明内容
本发明的目的是建立一种检测miRNA分子的简便、实用的方法及其配套试剂盒，用于miRNA及其前体的检测。
本发明的miRNA及其前体检测方法，其特征在于其检测方法是基于细胞和组织总RNA或小分子RNA的纯化，经多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3′端加上Poly(A)，再由oligo(dT)12-30-接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA或其前体相关序列和接头引物的互补序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA或其前体的DNA片段。反转录oligo(dT)12-30-接头引物一般长度为40～60nt，5′端为20～30nt的接头序列，3′端为12～30nt的oligo(dT)，还可以在3′末端加上两个碱基的A，G或C/A，G，C或T，最后两个碱基可以起锚定作用。接头引物互补序列引物为反转录oligo(dT)12-30-接头引物不包括dT部分的5′端序列。作为检测miRNA的PCR扩增引物的miRNA相关DNA序列可以是miRNA分子序列的全长，也可以是miRNA的部分序列，但是长度最好大于18nt。作为检测miRNA前体的PCR扩增引物的DNA序列可以是miRNA前体上的部分序列，但是长度最好大于18nt。PCR扩增miRNA或其前体所使用的相应的miRNA或其前体引物DNA序列的5′端可以加上一段接头引物。
由于本方法采用了在RNA分子的3′端加上poly(A)的方式，使小分子的RNA片段得以延长，因此适用于小分子RNA的检测。
miRNA及其前体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由RNA加Poly(A)尾反应系统、反转录系统和PCR扩增系统和对应的引物组成，该试剂盒包括1)多聚核苷酸聚合酶，及其反应缓冲液；2)反转录酶，及其反应缓冲液；3)Taq酶，及其反应缓冲液；4)反转录oligo(dT)12-30-接头引物、接头引物互补序列引物和miRNA或其前体PCR扩增用引物。
在PCR扩增反应体系中如果只加入miRNA扩增引物，就可以只检测相应的miRNA分子；如果在PCR反应体系中同时加入miRNA和miRNA前体扩增引物，就可以在同一个PCR反应中检测miRNA和其前体分子。对于成熟miRNA分子位于其前体分子5′端的miRNA在合适的反应条件下只用miRNA引物也可以在同一PCR反应中同时检测miRNA和其前体分子。
由于miRNA分子较小，因此，PCR反应产物最好用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。电泳结束后，可以用EB染色和银染的方法染色观察。
在PCR反应体系中还可以加入内对照引物进行半定量PCR反应，或对PCR引物进行荧光分子标记进行实时定量PCR反应。
本方法和相应的试剂盒可用于miRNA及其前体的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
结合
本发明的具体实施方法图1检测组织及细胞中成熟miRNA的表达电泳2检测组织及细胞中miRNA前体的表达电泳图实施例实施例一检测组织及细胞中成熟miRNA的表达以检测HepG2、Hela及人胎肝的miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c为例。
1.相关引物设计(1)反转录oligo(dT)12-30-接头引物为5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)30(A，G或C)(A，G，C或T)；(2)接头引物互补序列引物为5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG，为3′PCR引物；(3)miR-26a、miR-27a、miR-30b及miR-30c的5′PCR引物分别为miR-26a5′TTCAAGTAATCCAGGATAGGCTmiR-27a5′TTCACAGTGGCTAAGTTCCGCCmiR-30b5′TGTAAACATCCTACACTCAGCmiR-30c5′TGTAAACATCCTACACTCTCAGC2.cDNA的制备以HepG2、Hela及人胎肝为材料，用Ambion公司mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取其小分子RNA(≤200nt)(操作方法见其说明书)。各取1μg RNA用多聚核苷酸聚合酶(Poly(A)聚合酶)在3′端加上Poly(A)，反应条件如下RNA1μg10×缓冲液 5μlMnCl25μlDTT5μ10.1％BSA 10μlATP1mmol/LPoly(A)聚合酶 3UDEPC处理的H2O 加到50μl于37℃反应30分钟。之后加入50μl DEPC处理水，再加入100μl(等量)的苯酚/氯仿(1∶1)，充分混匀。12000rpm离心5分钟，取上清移至另一微量离心管中，再加入100μl(等量)氯仿，充分混匀后以12000rpm离心5分钟。取上清移至另一微量离心管中，加入2μl糖原(10mg/ml)、10μl(1/10量)的3mol/LNaAc(pH5.2)混匀。再加入250μl的冷无水乙醇，-20℃放置1小时。于4℃，以12000rpm离心20分钟，用75％的乙醇漂洗沉淀，室温晾干后溶于适量DEP℃处理的水中。
以上述处理的RNA为模板，以反转录oligo(dT)12-30-接头引物5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG(T)30(A，G或C)(A，G，C或T)为引物进行反转录反应(反应条件参考逆转录酶的说明书)，合成的cDNA即为PCR反应的模板。
3.PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析于20μl PCR反应体系中分别加入5′端的miRNA扩增引物及3′端扩增引物各0.5μg，0.25μl cDNA，再加入dNTP、PCR缓冲液及Taq酶。按下列条件进行PCR扩增94℃ 30秒、61℃ 30秒、72℃ 30秒，25个循环。取10μl PCR产物行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后进行结果分析。
图1中a为miR-26a，b为miR-27a，c为miR-30b，d为miR-30c；1为HepG2细胞，2为Hela细胞，3为人胎肝组织。M为DL2000 Marker，C为无模板对照。结果表明此方法可扩增miRNA，特异性较好。
回收扩增获得的miRNA的DNA片段，克隆至测序载体，测序结果证明所扩增序列正确。
实施例二检测组织及细胞中miRNA前体的表达以实施例一的cDNA为模板，以逆转录引物的接头序列5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG为3′端PCR引物，以miR-16-1、miR-30b及miR-30c-2前体的3′端部分序列为5′PCR引物，分别为miR-16-15′TGTGCTGCTGAAGTAAGGTTGAmiR-30b5′GGTGGATGTTTACTTCAGCTGAmiR-30c-25′GCTGGGAGAAGGCTGTTTACTC于20μl PCR反应体系中分别加入5′端及3′端PCR引物各0.5μg，0.25μl cDNA，再加入dNTP、PCR缓冲液及Taq酶。按下列条件进行PCR扩增94℃ 30秒、61℃ 30秒、72℃ 30秒，25个循环。取10μl PCR产物行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色后进行结果分析。
图2中a为miR-16-1，b为miR-30b，c为miR-30c-2；1为HepG2细胞，2为Hela细胞，3为人胎肝组织。M为DL2000 Marker，C为无模板对照。结果表明此方法可扩增miRNA的前体，特异性较好。
回收扩增获得的miRNA前体DNA片段，克隆至测序载体，测序结果证明所扩增序列正确。
权利要求
1.一种miRNA及其前体检测方法，其特征在于其检测方法是基于细胞和组织总RNA或小分子RNA的纯化，经多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3′端加上Poly(A)，再由oligo(dT)12-30—接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA或其前体相关序列和接头引物的可补序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA或其前体的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的方法，反转录oligo(dT)12-30—接头引物长度为40～60nt，5′端为20～30nt的接头序列，3′端为12～30nt的dT，在3′末端加上两个碱基的A，G或C/A，G，C或T，最后两个碱基起锚定作用。
3.根据权利要求1所述的方法，接头引物互补序列引物为反转录oligo(dT)12-30—接头引物不包括dT部分的5′端序列。
4.根据权利要求1所述的方法，作为检测miRNA的PCR扩增引物的miRNA相关DNA序列可以是miRNA分子序列的全长，也可以是miRNA的部分序列，长度大于18nt。作为检测miRNA前体的PCR扩增引物的DNA序列可以是miRNA前体上的部分序列，长度大于18nt。
5.根据权利要求1所述的方法，PCR扩增miRNA或其前体所使用的相应的miRNA或其前体引物DNA序列的5′端可以加上一段接头引物。
6.根据权利要求1所述的方法，在PCR反应体系中可以加入内对照引物进行半定量PCR反应，或对PCR引物进行荧光分子标记进行实时定量PCR反应。
7.同一种miRNA和其前体的检测可以在同一反应中进行，也可以分别进行。
8.一种miRNA及其前体检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由RNA加Poly(A)尾反应系统、反转录系统和PCR扩增系统和对应的引物组成，该试剂盒包括1)多聚核苷酸聚合酶，及其反应缓冲液；2)反转录酶，及其反应缓冲液；3)Taq酶，及其反应缓冲液；4)反转录oligo(dT)12-30—接头引物、接头引物互补序列引物和miRNA或其前体PCR扩增用引物。
9.上述任一项权利要求所述的方法，用于miRNA和其前体检测试剂盒。
10.本方法和试剂盒可用于miRNA及其前体的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
全文摘要
本发明涉及一种miRNA及其前体RNA的检测方法及检测试剂盒。其检测方法是提取细胞总RNA或小分子RNA，经多聚核苷酸聚合酶在RNA分子3’端加上Poly(A)，再由oligodT－接头引物进行反转录获得cDNA，以miRNA或其前体的相关序列和接头引物的互补序列为多聚酶链反应(PCR)引物，扩增获得相应的miRNA和其前体RNA。检测试剂盒由RNA加Poly(A)尾反应系统、反转录系统和PCR扩增系统和对应的引物组成。本方法具有简便、快速和适于大量样本检测的优点。本方法可用于miRNA及其前体的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
文档编号C12Q1/68GK1763223SQ20041008381
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者郑晓飞, 付汉江, 朱捷, 孙志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所