一个早期评估食管鳞癌发病风险的SNP及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及人外周血基因组dna并利用等位基因特异性pcr法去检测食管癌患者的5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-lo)c.760g＞a(e254k)位点情况进而早期评估食管癌发病风险的试剂盒。
背景技术：
：食道鳞状细胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)是我国一种常见的上消化道恶性肿瘤，在国人的恶性肿瘤死亡率中位居第四位。上世纪70年代，在全国范围内实施了恶性肿瘤普查，确立河北磁县、河南林县、山西阳泉、四川盐亭、广东潮汕和江苏淮安等地区为中国食管癌六大高发区。内蒙赤峰地区是我国北方食管癌较高发地区。我们的前期流行病学调查结果表明，该地区食管癌发病具有鲜明的蒙古族高发的特点。尤其是蒙古族牧民集中居住的牧区，食管癌的发病率最高，是危害当地蒙古族牧民的最主要恶性肿瘤，男性发病率远远高于女性。值得特别注意的是，赤峰地区蒙古族人发生食管癌有明显家族聚集性，比如我们初步的调查结果显示，在赤峰翁牛特旗一个牧场的200多户蒙古族居民中，近十年来发现有20余人患食管癌，情况十分严重，其中一个典型的例子是一家兄弟三人均因罹患食管癌死亡。早期评估食管癌发病风险对于临床早期诊断和预防具有重要意义。一些食管癌若早期发现是可以完全治愈的，因此，食管癌重在早期诊断。然而，目前除了做x线钡餐检查和胃镜外还没有一种简便无创的方法可以早期评估食管癌发病风险。做胃镜对患者来说比较痛苦，是一种有创性的检测手段，很多患者因为害怕做胃镜而错失早期诊断的机会。对于临床症状尚不明显的食管癌早期评估来说，需要一种快速简便且无创的检测方法来评估食管癌的发病风险，本发明所采用的试剂盒能够快速检测出与食管鳞癌高度相关的5-loe254k位点，与经典的测序法和酶切法相比具有简便、经济、快速等特点，与胃镜法相比对人体无伤害，属于无创性的早期检测方法，并且本发明所基于的等位基因特异性pcr法是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。本试剂盒中5-脂氧合酶的背景介绍如下。花生四烯酸和白三烯等脂类物质代谢异常在食管癌的发生发展中发挥着十分重要的促进作用，而5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-lo)是机体催化花生四烯酸生成生物活性分子从而影响细胞信号传导及代谢的关键酶。人类的5-lo基因定位于第10号染色体p11.2亚带，长度超过82kb，包括14个外显子和13个内含子，5-lo蛋白包含674个氨基酸，编码蛋白的分子量约为72～80kd。其cdna760位的g突变成a，760g＞a位于第六个外显子中，在基因库中也有记载，其对应的254位的氨基酸由带负电荷的谷氨酸(e)突变成带正电荷的赖氨酸(k)，这一单核苷酸多态性(snp)引起了电荷的改变对酶的功能或者该酶与其他酶之间的相互作用都有可能受影响。有研究证明我国人群中5-脂氧合酶基因e254k多态性与哮喘的发生有关，与食管癌的发生是否有关尚不清楚。该研究的目的在于检测该多态性在食管癌患者中的分布情况，同时与正常人群中的分布情况进行对比，进而揭示该多态性与食管癌发生的关系。该研究证实，5-locdna第760位的碱基g突变成碱基a，使相应的254位氨基酸由谷氨酸glu(e)变成了赖氨酸lys(k)。该突变与食管癌的发生高度相关，该结果为家族性食管癌发生提供了一个新的机制。基因突变位点的检测方法很多，经典的方法是测序法。测序法需要先对目的片段进行pcr扩增、电泳、切胶、纯化、测序反应和测序。而且测序仪价格昂贵，很多医院不具备购买的条件。本发明采用的等位基因特异性pcr(as-pcr)法可快速检测5-lo的snp位点，快速直接进行分型，不需要测序和酶切，具有经济、快速、简便、易行等特点，是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。as-pcr技术的关键在于引物设计，本发明采用自行设计的引物和检测条件，可快速检测到5-loc.760g＞a(e254k)位点情况。虽然x线钡餐和胃镜检查是常用的食管癌检查手段，但这类检查属于有创性的，不适合经常进行。本发明通过对5-loc.760g＞a(e254k)位点的检测，可以对食管癌进行早期风险评估，对高危组要进行早期预防。而且本发明是通过检测外周血的基因组dna，属于无创性的检测，更容易被患者接受。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种基于等位基因特异性pcr方法早期评估食管癌发病风险的试剂盒。其中，上述的等位基因特异性pcr方法主要是检测人外周血基因组dna。其中，上述试剂盒主要包括针对5-脂氧合酶(5-lo)c.760g＞a位点设计的上游等位基因特异性引物2条(野生型引物p1，5′-cgctgcacagagctgcctg和突变型引物p2，5′-cgctgcacagagctgccta)，下游引物1条(p3，5′-cgcaattcctcctctgatgt)，和一对内参照引物(p4，5′-agaggcgaagttctccaaca和p5，5′-aacagggacggagagtgatg)。其中，上述试剂盒还包括：pcrmix(北京百泰克公司)、dnamarkeri(北京百泰克公司)和灭菌水。附图说明图1是as-pcr法检测食管癌患者的5-loc.760g＞a位点的电泳图(每个样本分a和b两管，a管加的是该位点野生型引物，b管是突变型引物，若目的条带a有b没有，是野生型(gg)，属低危组；只要b管中出现目的条带，就属于高危组。a和b管都有目的条带，则基因型为ga型；只在b管有目的条带，则基因型为aa型)。第1泳道为markeri，条带从上到下为600、500、400、300、200、100。第2和3泳道为一个样本，结果显示为a管除了有600bp的内参照条带外还有301bp的目的条带，而b管未出现目的条带，说明为野生型gg。第4和5泳道为一个模板，也是野生型gg。第6和7泳道为一个样本，结果显示a管和b管，除了有内参照条带外都出现了目的条带，说明是杂合突变型ga；第8和9泳道为一个样本，也是杂合突变型ga。图2是对as-pcr法进行测序验证，以6s为引物对样本m8有意链进行测序的结果。结果与as-pcr检测结果一致，样本m8为杂合突变型ga。图3是以6a为引物对同一个样本m8反义链进行测序的结果。与图2双向测序结果一致。图4是以6s为引物对样本m19有意链进行测序的结果。结果与as-pcr检测结果一致，样本m19为野生型gg。图5是以6a为引物对同一个样本m19反义链进行测序的结果。与图4双向测序结果一致。具体实施方式我们收集了160例食管癌患者和204例正常对照的外周血。下面结合附图实施例作进一步详细描述。等位基因特异性pcr法步骤如下。(1)分a和b两管，两管的不同点在于a管中加入上游野生型的引物p1，b管中加的是上游突变型引物p2，其余都相同。(2)pcr反应体系：a、b管中加入成分见下表。a管b管灭菌水：5μl灭菌水：5μlpcrmix：10μlpcrmix：10μldna模板：1μl(100-150ng/μl)dna模板：1μl(100-150ng/μl)p1：1μl(10μm)p2：1μl(10μm)p3：1μl(10μm)p3：1μl(10μm)p4：1μl(10μm)p4：1μl(10μm)p5：1μl(10μm)p5：1μl(10μm)total：20μltotal：20μl(3)pcr反应条件为：95℃预变性5分钟，然后按95℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟循环35次，末次循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。(4)琼脂糖凝胶电泳：pcr扩增后取pcr产物5-10μl，进行2％的琼脂糖凝胶电泳，鉴定pcr扩增的结果，取5μldnamarkeri作为标记，条带分别为600、500、400、300、200、100。(5)eb浸染：电泳后的凝胶取出放入eb浸泡液中，eb是致癌物，戴一次性手套小心操作。有eb的手套不能碰其他任何东西，包括鼠标、电脑等，用完后放入指定的垃圾箱。(6)放射自显影：将浸染后的胶取出，放入凝胶成像仪的指定位置，打开设备，拍照，保存两种格式，一种是jpg格式，一种是自动成像格式。(7)分析电泳结果：若目的条带a有b没有，是野生型(gg)，属低危组；a和b管都有目的条带，则基因型为ga型；只在b管有目的条带，则基因型为aa型。只要b管中出现目的条带，就属于高危组。如图1。数据的统计学处理。食管癌组与正常对照组间5-loc.760g＞a(e254k)位点基因频率和基因型频率的比较采用t检验方法；p＜0.05被认为有统计学显著性。统计结果显示：在食管癌患者中5-loc.760g＞a(e254k)位点基因突变发生的频率是正常对照组的7.19倍，p＜0.05有显著性差异。测序验证：另外设计一对引物，分别在snp位点的上下游，5-lo6s：5`-gcagggactctgctcttagg，5-lo6a：5`-cgcaattcctcctctgatgt。测序验证结果显示：as-pcr法检测与测序法检测结果一致率为100％。结论1：检测5-脂氧合酶e254k多态性在食管癌患者中的分布情况，同时与正常人群中的分布情况进行对比，研究结果显示该多态性与食管癌发生有关。结论2：临床上早期评估个体食管癌发病风险时，用as-pcr法检测5-loc.760g＞a(e254k)位点，若目的条带a管有b管没有，是野生型(gg)，属低危组；a和b管都有目的条带，则为杂合突变基因型为ga型；只在b管有目的条带，则为纯合突变基因型为aa型。只要b管中出现目的条带，就属于高危组。结论3：用as-pcr法可快速检测5-lo的e254ksnp位点，具有经济、快速、简便、易行等特点，是一种成熟可靠、可在基层医院广泛使用的方法。当前第1页12