基于适体的靶向激活循环放大spr检测蛋白质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 核酸适体是人工合成的，利用SELEX技术筛选出来的能够与目标分子特异性识别 和高亲和力结合的DNA和RNA单链寡核苷酸。与未修饰的RNA组成的适体容易被血清中的核 糖核酸酶消化相比，DNA适体与靶分子的结合活性具有较宽的适用范围。除此之外，与传统 的抗体技术相比，适体在合成，标记，传递信号，放大等方面展现的独特的优越性使其在生 物检测分析中得到广泛的应用。
[0003] 迄今为止，基于适体的生物分析在生命科学和工业分析领域已经得到广泛的关 注。一些研究小组利用适体与靶分子结合产生的构象转变作为切入点设计了新型的检测探 针和信号检测机理用于光学和电化学分析系统中。然而，由于适体与其靶分子之间相对较 低的结合常数，利用传统的转换机理难以设计高灵敏的检测探针。因此，对于基于适体技术 的生物传感系统，研制相应的信号放大机理来进一步提高检测灵敏度是至关重要的。
[0004] 在DNA循环放大技术中，链替代聚合反应（strand-displacement polymerization，SDP)，作为一种等温核酸循环放大技术在适体分析系统中已经引起了高 度的注意。在这一循环体系中，在靶分析物的作用下，引物能够与模板链互补杂交，随后利 用聚合酶的作用，引物在模板链上发生聚合生长反应，将靶分析物从模板链上替换下来，释 放出的靶分析物又会引发循环的放大过程，从而不断的放大靶分析物的识别绑定单元。在 链替代聚合为基础的适体传感分析系统中包含两种反应机理：核酸链替代聚合反应 (nucleic acid strand-displacementpolymerization，NDP)和革巴分子替代聚合反应 (target molecule-displacement polymerization，TDP)。在NDP反应中，核酸链能够通过 循环的聚合反应替换下来，而在TDP反应中，发生循环替代反应的是靶分子，如蛋白质、小分 子等。
[0005] 溶菌酶是生物体内普遍存在的一种蛋白质，它能够催化细菌多糖壁上的乙缩醛基 团的裂解。在正常的生理条件下，人体组织和分泌物中的溶菌酶浓度较低。而据文献报道， 血清、尿液和细胞中溶菌酶浓度的改变与白血病、肾脏疾病及脑膜炎等疾病具有密切的联 系。因此，溶菌酶的特异性识别和高灵敏检测在基础研究及临床医学中具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种基于适体的靶向激活循环放大 SPR检测蛋白质的方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，步骤如下：
[0009] (1)基底上发夹结构的检测探针DNA S1既含有靶蛋白的适体序列，又具有剪切酶 的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与DNA S1上的适体序列部分特异性结合， 使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNA S1上3'端的茎部暴露出来；
[0010] (2)纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕 获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚合反应引物的DNA S2,所述DNA S2与步骤(1)打开的发夹探针互补杂交后，以发夹探针为模板链复制，将靶蛋白质从DNA S1 上替换下来，替换下来的靶蛋白与其他的发夹探针结合，引发新的靶分子的替换聚合反应， 同时，由于发夹结构的检测探针上还具有剪切酶的识别序列，当引物沿模板链聚合生长形 成双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处在模板链对应的互补序列上形成 缺口，随后再在DNA聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模板链聚合生长，将形成缺口 的另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板链互补的序列，也能和其他 的发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的核酸链替代聚合反应，结合靶分子的替换 聚合循环放大，形成了双重循环放大体系；
[0011] (3)将步骤(2)反应结束后得到的基底进行表面等离子共振检测。
[0012]优选:所述步骤⑴中待测系统中的PBS缓冲溶液的pH为6.5-8.5，更优选7.4。
[0013]所述步骤(2)中双重循环放大反应的反应温度为20-50°C，更优选37°C;反应的时 间为 1 〇_150min，更优选 90min。
[0014] 所述步骤(1)发夹结构探针的浓度为5.0 X 10-8Μ-1.0 X 10-5Μ，更优选5.0 X 10-7Μ。
[0015] 所述步骤(2)纳米金生物条码探针上S3/S2为1:1-50:1，更优选20:1。
[0016] 所述步骤(2)中DNA聚合酶的用量为0.05UyL-Μ. 5UyL-1，更优选DNA聚合酶的用量 为0.3肌-、
[0017] 所述步骤⑵内切酶的用量为〇. ΟδυμΙ^-Ο. δυμΓ1，切刻内切酶的用量为0.3UyL'
[0018] 所述步骤(3)具体为:将基底固定在SPR检测仪上，通入DNA功能化的量子点信号探 针，进行表面等离子共振检测，所述量子点信号探针上固定的DNA S4能够与双重循环放大 反应的产物互补杂交，增强检测信号。
[0019] 所述靶蛋白为溶菌酶。
[0020] -种利用表面等离子共振检测蛋白质的试剂盒，基底上发夹结构的检测探针、纳 米金生物条码探针，所述基底上发夹结构的检测探针DNA S1既含有靶蛋白的适体序列又具 有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与发夹结构的检测探针DNA S1 上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNA S1上的3'端的茎部暴露出来;所述纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获 量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚合反应前 体的DNA S2，核酸链替代聚合反应体系和靶分子替代聚合反应体系。
[0021] 当使用上述方法检测溶菌酶时，所述S1、S2、S3、S4的序列如SEQIDN0.1、SEQID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示。优选：51、52、53、54如下表：
[0022] DNA S1既包含靶蛋白的适体序列又包含了剪切酶的识别序列，其中加粗的部分是 指溶菌酶适体序列，斜体部分是指切割酶的识别序列）
[0023]
[0025]本发明的有益效果：
[0026]本发明提出了一种基于靶向激活双重循环放大的SPR检测溶菌酶的新方法。基于 适体与靶分子结合产生构象转变的性质，设计了检测探针，将靶分子与适体的特异性识别 作用转化成双重循环放大的切入点，从而引发靶分子的聚合替换源头放大和DNA链的聚合 剪切放大反应，提高了反应的放大效率，以生物功能化的量子点探针为信号标记，利用表面 等离子共振检测技术实现了溶菌酶的快速、灵敏检测。而且通过对人血清样品中溶菌酶的 检测进一步证实了该方法的实际应用性能，适于复杂样品的检测。该生物传感系统灵敏度 高、选择性强、设计简单、操作便捷等特点使其在蛋白质分析及临床诊断方面展现了广阔的 应用前景。
[0027] 将靶向激活的双重循环放大体系用于SPR检测蛋白质的方法中，以同一个检测探 针为放大模板，基于靶蛋白质对于适体的特异性识别作用引发循环的靶分子聚合替换及链 聚合剪切反应，实现双重放大效果，提高了检测灵敏度，检测限可达76fM。
[0028] 基于靶与适体结合的结构互变性质引发的循环放大反应对于复杂生物样品的检 测具有较好的选择性的。
【附图说明】
[0029]图1为基于靶向激活循环放大的SPR检测溶菌酶示意图；
[0030]图2为金纳米粒子的透射电镜图片；
[0031]图3为紫外-可见吸收光谱图：（a)DNA S2;(b)DNA S3;(c)金纳米粒子；（d)纳米金 生物条码探针；
[0032]图4为基于靶向激活循环放大体系SPR检测对照实验：（a)空白实验；（b)无聚合酶； (c)无核酸内切酶；（d)溶菌酶、聚合酶、核酸内切酶存在;溶菌酶浓度，1.0 X 1 0-ηΜ;
[0033] 图5为缓冲溶液pH值的优化，溶菌酶浓度，1 .ΟΧ 10-12Μ;
[0034] 图6为循环反应温度的优化，溶菌酶浓度，1.0 X 10-12Μ;
[0035] 图7为捕获探针浓度对S