>[0094]循环反应体系中，酶的用量会直接影响大放大效率，酶的用量过大，会造成药品的 浪费，用量不足，会使循环反应不能充分进行，影响检测灵敏度。因此本实验对循环反应体 系中聚合酶、核酸内切酶Nb. BbvCI的用量分别进行了优化，实验中所用的溶菌酶的浓度为 1.0 X 10-12Μ，在固定剪切酶的用量，通过向反应体系中加入不同量的聚合酶，观察SPR检测 信号的变化。如图10所示，在聚合酶的用量从〇. ΟδυμΓ1增加到0.的变化过程中，随着 聚合酶用量的增大，SPR检测信号不断增强，这是由于随着聚合酶用量的加大，聚合反应的 完成效率不断提高，而当聚合酶用量大于0.21^1/ 1后，继续增加反应体系中聚合酶的用量， SPR检测信号趋于平稳，出现平台。说明体系中聚合反应所需的聚合酶已基本达到饱和，考 虑到经济和聚合效率的影响，我们选择0.21^1/ 1作为体系中聚合酶的最佳使用量。随后，我 们固定聚合酶的用量为〇. ，通过向反应体系中加入不同量的剪切酶，观察SPR检测信 号的变化。由图11可以看出，在剪切酶用量达到〇. 时，循环反应达到饱和点，因此我们 选择0.作为剪切酶Nb. BbvCI的最佳用量。
[0095] 2.6SPR检测溶菌酶的灵敏度
[0096] 在最佳的实验条件下，我们考察了溶菌酶的检测灵敏度。图12为不同浓度的溶菌 酶进行靶向激活循环放大SPR检测得到的共振角实时变化曲线。从图中可以看出，当溶菌酶 浓度在1.0 X 10_13~5.0 X 10-ηΜ之间变化时，SPR响应信号的强度随靶DNA浓度的增加而增 大。
[0097] 图13为共振角度的变化对溶菌酶浓度的工作曲线，以溶菌酶浓度的对数值为横坐 标，不同浓度的溶菌酶SPR检测信号值为纵坐标绘制标准工作曲线。从图中可以看出，溶菌 酶检测的线性范围为1.0X10- 13~5.0X10-ηΜ，线性回归方程为Y = 0.37261og1QC+4.8762(Y 为扣除空白溶液响应后的S P R响应信号的变化，C为溶菌酶的浓度），线性相关系数为 0.9896，检测限为7.6 X 10-14M(S/N=3)。对1.0 X 10-12的靶DNA进行11次的平行测定，相对标 准偏差为8.2%，表明该检测方法具有良好的精密度和重现性。
[0098] 2.7溶菌酶检测的选择性
[0099]除了检测灵敏度，选择性是评价检测体系的另一个关键因素。对于适体感应系统， 检测的特异性主要由适体的内在性质所决定的。尽管溶菌酶的适体链对靶分子具有特异性 识别作用，但是在本实验体系中，适体序列被包含在探测探针中，有可能会影响适体序列对 靶物质的识别能力。为了考察该检测体系的选择性，我们在相同实验条件下对非靶蛋白质 对反应体系的影响进行了研究。如图14所示，当没有溶菌酶存在的条件下，检测信号十分微 弱，说明含有适体序列的发夹结构的检测探针能提高反应的选择性而且通过使用PBS缓冲 溶液对金片进行彻底地冲洗能够去除金膜上非特异性吸附的物质。假设相同实验条件下， 低浓度的溶菌酶产生的检测信号为1〇〇%，而在反应体系中加入较高浓度的非靶蛋白质时， 它们所产生的相对的SPR检测信号还不足3.0%。实验结果表明，观测到的检测信号是由溶 菌酶和适体之间特异性的结合作用所产生，该检测方法具有较好的选择性。
[0100] 2.8SPR检测体系的实用性研究
[0101]为了验证该方法在实际临床应用中的可行性，采用加标回收法，将不同浓度的溶 菌酶加入到人血清样品中，测得加标回收率为96.3~103.7 %，相对标准偏差为5.6~ 7.1 %。实验结果如表2，该方法具有实际临床应用潜力，能够对复杂生物样品进行分析检 测。
[0102]表2血清样品中SPR检测溶菌酶的回收率
[0103]
[0104] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，其特征是:步骤如下： (1) 基底上发夹结构的检测探针DNA S1既含有靶蛋白的适体序列，又具有剪切酶的识 另IJ序列，当待测系统中具有靶蛋白时，革巴蛋白与DNA S1上的适体序列部分特异性结合，使发 夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探针DNA S1上3 '暴露出来； (2) 纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分别是捕获量子点信号探针的捕获链 DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补，充当聚合反应引物的DNA S2,所述DNA S2与 步骤(1)打开的发夹探针互补杂交后，以发夹探针为模板链复制，将靶蛋白质从DNA S1上替 换下来，替换下来的靶蛋白与其他的发夹探针结合，引发新的靶分子的替换聚合反应，同 时，由于发夹结构的检测探针上还具有剪切酶的识别序列，当引物沿模板链聚合生长形成 双链结构时，在内切酶的作用下，在双链的识别位点处在模板链对应的互补序列上形成缺 口，随后再在DNA聚合酶的作用下，引物链从缺口处继续沿模板链聚合生长，将形成缺口的 另一段单链替换下来，释放出的单链DNA由于具有较多与模板链互补的序列，也能和其他的 发夹探针互补杂交，将发夹打开，从而引发新的核酸链替代聚合反应，结合靶分子的替换聚 合循环放大，形成了双重循环放大体系； (3) 将步骤(2)反应结束后得到的基底进行表面等离子共振检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(1)中待测系统中的PBS缓冲溶液的pH 为6.5-8.5,更优选7.4。3. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)中双重循环放大反应的反应温度 为20-50°C，更优选37°C ;反应的时间为10_150min，更优选90min。4. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤（1)发夹结构探针的浓度为5.0乂1〇-8M-1 · 0 X 10-5M，更优选5 · 0 X 10-7M。5. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)纳米金生物条码探针上S3/S2为1: 1-50:1，更优选 20:1。6. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)中DNA聚合酶的用量为0.05伽1/1-0.5UyL-1，更优选DNA聚合酶的用量为0.。7. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(2)内切酶的用量为0. ΟδυμΙ^-0.51]μ L一1，切刻内切酶的用量为0.3UyL一1。8. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述步骤(3)具体为:将基底固定在SPR检测仪 上，通入DNA功能化的量子点信号探针，进行表面等离子共振检测，所述量子点信号探针上 固定的DNA S4能够与双重循环放大反应的产物互补杂交，增强检测信号。9. 如权利要求1所述的方法，其特征是:所述靶蛋白为溶菌酶。10. -种利用表面等离子共振检测蛋白质的试剂盒，其特征是:基底上发夹结构的检测 探针、纳米金生物条码探针，所述基底上发夹结构的检测探针既含有靶蛋白的适体序列DNA S1，又具有剪切酶的识别序列，当待测系统中具有靶蛋白时，靶蛋白与发夹结构的检测探针 DNA S1上的适体序列部分特异性结合，使发夹结构的检测探针被打开，发夹结构的检测探 针DNA S1上的3'端的茎部3'暴露出来，所述纳米金生物条码探针上组装了两种DNA分子，分 别是捕获量子点信号探针的捕获链DNAS3和能够与打开的发夹结构探针杂交互补并充当聚 合反应前体的DNA S2，核酸链替代聚合反应体系和靶分子替代聚合反应体系。
【专利摘要】本发明公开了一种基于适体的靶向激活循环放大SPR检测蛋白质的方法，本文基于适体与靶分子的结构互变性质，构建了靶向激活双重循环放大的SPR检测系统用于溶菌酶的检测。将靶分子与适体的特异性识别作用转化成双重循环放大反应的切入点，从而引发靶分子的聚合替换源头放大和DNA链的聚合剪切放大反应，提高了反应的放大效率及选择性，以溶菌酶作为目标分析物，生物功能化的量子点探针为信号标记，利用表面等离子共振检测技术实现了溶菌酶的快速、灵敏检测，检测限可达76fM。并成功应用于人血清实际样品中溶菌酶的分析。该方法适用范围广、选择性强、操作便捷，在蛋白质分析及临床诊断方面具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, G01N33/553, G01N33/68
【公开号】CN105648069
【申请号】
【发明人】何鹏, 隋永鹍, 乔文苹, 张书圣
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月25日