一种链特异性全基因组范围内研究apa的方法
【技术领域】
[0001] 本发明 SS_3T_seq(Strand-specific 3'Terminal Sequencing)涉及一种链特异 性mRNA 3'末端非编码区高通量测序文库的构建方法，用于在全基因组范围内研宄选择性 多聚腺苷酸化（Alternative Polyadenylation，APA)〇
【背景技术】
[0002] 在全基因组范围内研宄APA变化现有的技术有多种，但方法原理都相近，现列举 出两种最具有代表性的。
[0003] 图1和图2展示了这两种方法的实验原理图：
[0004]图 1 是 SAPAS(Sequencing APA Sites)，将 RNA 直接加热断裂后，用含有 oligo dT的引物逆转录出第一链cDNA，链置换的方法合成双链cDNA。然后用突变的〇1 igo dT(TTTTCTTTTTTCTTTTTT)与测序接头连接作为PCR引物扩增，扩增出的产物中则不含有多 聚A(poly A)结构，以此避免多聚结构对测序质量的影响。SAPAS法的缺点是不能彻底消除 多聚A未切除对高通量测序质量的影响。
[0005] 图 2 是 3P_Seq (Poly (A) Position Profiling by sequencing)，用 oligo dT 将含 有多聚A序列的RNA筛选出后，3'端加上一个带生物素（Biotin)修饰的RNA接头，然后经 过RNase T1断裂RNA后用含有链霉亲和素的磁珠（Beads)筛选含有多聚A的片段，再用只 含有dTTP的逆转录体系将多聚A结构逆转录成杂合双联，利用RNase H的特性水解多聚A 结构，将含有APA位点的片段从磁珠上释放下来，两端加上RNA接头后合成双链cDNA，PCR 扩增后即为可用于测序的文库。3P_Seq法的缺点是RNA水平操作繁杂，需经过多步的RNA 连接和酶切，对RNA的损伤和损失也较大，不适用于少量样品文库的构建，且此方法难度较 大、成本较高。
[0006] 此外，以上两种方法的断裂方式都具有局限性，RNase T1酶切断裂（3P-Seq)和 RNA直接加热断裂（SAPAS)的方法不能做到既能不损伤RNA同时又能随即断裂。且很多 基因组同一区域同时具有正负链的转录本，而现有技术方法均不可知转录本链的方向性信 息，即测序所得的序列来自DNA双链的正链还是负链。
[0007] 因此本领域技术人员致力于开发一种尽可能减少RNA水平操作，在DNA水平移除 多聚A序列，消除多聚结构对测序的影响的方法，同时该方法又能保留链的方向性信息。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种链特异性全基因组范围内研宄APA的方法，该方法在 DNA水平移除多聚A序列，同时又能保留链的方向信息。
[0009] 本发明提供的方法名为链特异性3'端测序法（SS-3T_seq，Strand-specific 3' Terminal Sequencing)，该方法用于在全基因组范围内研宄APA的变化。
[0010] 所述方法包括以下步骤：
[0011] (1)构建一种特殊的含有oligo dT的磁珠，用这种磁珠筛选含有多聚A的RNA，所 述磁珠既能筛选含有多聚A的RNA，同时又含有酶切位点移除文库中的多聚A结构；
[0012] (2)在磁珠上逆转录合成第一链cDNA，逆转录体系中用甲基化的dCTP替代正常的 dCTP ；
[0013] (3)用特殊的dNTP合成双链cDNA，所述特殊的dNTP是指其中用dUTP代替dTTP， 经过断裂后磁珠上留下的即为含有APA位点的片段；
[0014] (4)再经过Gsu I酶切除去多聚A结构，将目的片段从磁珠上释放下来；
[0015] (5)目的片段两端经过修饰后添加Illumina测序接头；
[0016] (6)经过片段大小筛选后，用USER酶处理以除去第二链中的dUTP，只剩余第一链 做PCR扩增，即得到用于Illumina二代测序的文库。
[0017] 优选地，在本发明方法进行之前，先对抽提的总RNA进行质量检测，所述质量检测 的方法可以是琼脂糖甲醛变性电泳或者用安捷伦2100Bioanaly Zer检测，高质量的RNA做 起始材料对精确分析APA变化很重要。
[0018] 优选地，本发明方法适用于10 y g-100 y g的总RNA做为起始材料。
[0019] 优选地，步骤（3)中合成双链cDNA的过程中采用RNase H、Ecoli. DNA Polymerase、Ecoli. DNA ligase 三种酶。
[0020] 优选地，步骤（5)中所述目的片段的两端修饰是指形成平末端，且在5'端加上磷 酸化基团，在3'端添加一个碱基A ;所述添加Illumina测序接头的具体方法为将修饰后的 目的片段与Illumina P5/P7接头连接，连接酶优选为T4DNA ligase。
[0021] 优选地，步骤（6)中所述片段大小筛选采用2. 5%的琼脂糖凝胶电泳分离片段。
[0022] 本发明方法的原理图参见图3,以下进一步描述本发明的原理。
[0023] (一）关于特殊oligo dT磁珠的构建
[0024] 普通的商业oligo dT磁珠用于筛选含有多聚A的RNA，而经过改进后的oligo dT 磁珠既能筛选含有多聚A的RNA，同时含有酶切位点移除文库中的多聚A结构。
[0025] 本发明所述构建的特殊的磁珠具有以下特点：
[0026] (1)oligo dT的3'端最后两个T之间用硫代磷酸修饰，能够在后期片段末端修饰 的时候保护APA位点不被核酸外切酶意外切除，同时保留4个T在APA位点旁边用于后期 数据处理时数据的筛选；
[0027] (2)oligo dT序列的5'端加上一个Gsu I的酶切识别位点以及9个碱基的保护序 列，用以多聚A结构的移除；
[0028] (3)引物的5'端添加生物素修饰，用以连接带有链霉亲和素的磁珠。
[0029] 进一步地，与磁珠相连的引物序列如下：
[0030] 5, -Biotin-GAGCTAGITCTGGAGITITITITITITITITITITVN-3,其中第 19 位 T 和第 20 位T之间是用硫代磷酸修饰的。
[0031] (二）关于断裂方式的选择
[0032] 可以选择的DNA断裂方式包括超声断裂、DNase I处理等方法，但是超声断裂的方 法若控制不好很容易将整个DNA分子从磁珠上断裂下来，DNase I反应剧烈不容易控制断 裂产物片段大小。
[0033] 为了减少对RNA的损伤，本发明优选地采用在DNA阶段断裂。双链cDNA合成后， 使用双链cDNA断裂酶将双链cDNA断裂成200-400bp的片段，经过磁珠筛选后，挂在磁珠上 的片段即为靠近RNA 3'端且含有多聚A位点的片段，其中所述双链cDNA断裂酶优选为NEB 公司的产品。
[0034](三）关于移除多聚A结构的策略
[0035] 为了方便操作和降低实验难度，本发明选择在DNA水平移除多聚A结构。在逆转 录时，在oligo dT的5'端引入Gsu I的酶切识别位点，Gsu I是一种第三型限制性内切 酶，在识别位点的下游16个碱基的位置切割形成两个碱基的粘性末端，而且具有一种甲基 化封闭特性。当识别位点（CTGGAG)中的碱基C被甲基化时，则这个识别位点被封闭，无法 识别。由于多聚A结构的移除的同时也将文库片段从磁珠上释放下来，为了防止移除多聚 结构时文库片段上也含有这个酶切位点造成APA位点的假阳性，本发明在逆转录的时候使 用甲基化的dCTP替代正常的dCTP，而在第二链cDNA合成的时候换回正常的dCTP，这样就 可以在保证设计的Gsu I酶切位点完好的同时使其他识别位点被甲基化封闭，避免的假阳 性结果的产生。
[0036] (四）TTTT标签用于筛选数据精确定位APA位点
[0037] 本发明设计用于反转的引物中含有20个T，Gsu I移除多聚A时切去16个，留下 4个T的粘性末端在末端修饰时被切除，所以真正留在文库片段上的是含有硫代磷酸修饰 的4个T用以标记文库片段的APA位点。
[0038] 本发明具有以下有益技术效果：
[0039] 1、实验操作简单，RNA水平操作较少，简化实验流程，降低步骤繁琐引起的损失，同 时降低实验难度和造价，使其应用范围更广；
[0040] 2、DNA水平移除多聚A结构，提高测序质量，使APA的鉴定更加准确；
[0041] 3、DNA水平断裂与现有断裂方式相比减少了对RNA的损伤，提高了产率；
[0042] 4、二链合成时加入特殊dNTP(dUTP代替dTTP)，最后USER酶处理，除去二链