用于特异性分离目标核酸的方法
【专利说明】用于特异性分离目标核酸的方法
[0001] 本发明涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标微生物和/或目标核酸的方 法，所述液体生物样品包含或可能包含特别是许多非靶标细胞和/或许多非靶标细胞的核 酸。本发明还涉及其用途，基于分离目标微生物的方法或分离目标微生物的核酸的方法的 诊断试验，以及在液体生物样品中分离目标微生物和/或目标微生物的核酸的试剂盒，所 述液体生物样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括目标微生物、非靶标细胞和任选的 目标微生物和/或非靶标细胞的碎片。
[0002] 现有技术包括若干科技出版物和专利。因此，在1992年，Baker等人描述了使用称 为皂苷的试剂来差异裂解人细胞并从全血分离疟原虫病原体。他们证明具有低终浓度（大 约0. 015% )的皂苷可以在20 μ L的柠檬酸盐缓冲的全血中裂解人细胞，并提供足够干净的 裂解物以进行PCR检测。
[0003] 专利申请ΕΡ-Α-0, 745, 849重复了这种差异方法，将皂苷用于更大体积的全血 (5mL)，最终浓缩皂苷溶液为大约0. 020-0. 125%。
[0004] 另一个专利申请EP-A-2, 185, 681提供一种制备皂苷溶液的方法，使用更加浓缩 的皂苷溶液，即2-10%的终浓度用于平均规模的全血体积，即5mL。本发明提供用于这类皂 苷溶液的低渗或生理缓冲液。
[0005] 但是，目前市面上没有用于分离和鉴定大体积生物样品中非常少量的致病性细胞 的快速溶液。例如，对于败血病，必须能够在少于6小时内鉴定IOmL全血中1到10个集落 形成单位（CFU)的病原体，或在最困难的情况下，鉴定超过SOOyg非靶标（人）核酸中靶 标病原体的Ifg核酸。
[0006] 因此在传染性疾病诊断中遇到的问题是：
[0007] 1)基质样品的复杂性，一方面通常包括非常少的病原体细胞，另一方面包括非常 多的人细胞及其他细胞或颗粒，这些必须被去除以便它们不干扰病原体的分离和鉴定，和
[0008] 2)从非常大的样品体积分离非常少量病原体的生理限制。
[0009] 概括来说，挑战是除去最大量的非靶标成分（细胞和/或颗粒）并保留最大量的 致病性靶标（最初存在很少），以便人为增加它们的浓度并便于它们的检测。
[0010] 本文描述的发明是一种可以在相对较短的时间内从大体积的生物样品（例如大 约IOml)分离和鉴定少量病原体的方法。这些病原体是，非完全地，细菌、病毒和真菌。本 发明能够鉴定IOmL全血中低至3CFU的数量（即0. 3CFU/mL)，这是一个先前文献中从未报 道过的检出限。其新颖性是基于：
[0011] 1.相对于临床要求（〇. 1-lCFU/mL)，这是之前从未达到的有吸引力的检出限（大 约 0· 3CFU/mL)〇
[0012] 2.可以使用利用EDTA或柠檬酸盐（而且可以是肝素）缓冲的各种全血的能力。 肝素是一种医院大量使用的试剂，但在分子生物学方法中经常被拒绝，因为其能够阻止核 酸扩增和基于酶的反应。本发明可以处理用肝素缓冲的血液，文献描述的分子方法通常并 非如此。
[0013] 3.使用IOmL以上大体积全血的能力。
[0014] 4.使用聚乙二醇（PEG)促进病原体的沉淀。通过PEG沉淀DNA或病毒在文献中已 充分描述。但是，本领域不存在利用PEG沉淀细菌细胞或真菌诸如酵母。因为皂苷是一种 类似于去污剂的试剂，致病性细胞或颗粒可以在管内部漂浮，或在离心作用下很难沉淀到 管底部。尽管在一些处理样品中不需要，但是添加 PEG可以保证靶标的沉淀，这是稳定的， 没有漂浮的风险。此外，PEG的这种添加促进包含病原体的沉淀物粘附到塑料管上，并耐受 表面冲洗。
[0015] 5.将利用皂苷的差异裂解与基于高度浓缩的核酸酶的处理组合；换句话说，非靶 标细胞的裂解，这将释放它们的核酸，其随后将被核酸酶的处理而降解。这种差异裂解释放 大量的人核酸。从IOml全血中通常可以提取880 yg人DNA。当目标是检测非常低拷贝数 的致病性核酸时，这些人核酸是重要问题的根源：
[0016] i)在纯化致病性靶标核酸期间它们竞争饱和核酸捕获剂，因为它们是过量的（例 如娃质膜，磁性娃质珠子，层析或亲和基质，等等），
[0017] ii)在致病性分子的扩增期间它们起干扰作用。通过人核酸的最大量去除，提高了 检出限。根据这些关键要点，本发明在利用皂苷裂解后，使用大量核酸酶来去除最大量的人 核酸。文献中从没关于将皂苷与高度浓缩的核酸酶处理组合的报道。
[0018] 6.最后，我们证明了缓冲的皂苷溶液（pH为6-9)，可以阻止不希望的血液成分，尤 其是红细胞的沉淀。之前已经有科学家使用接近于PH 7的缓冲液用于皂苷溶液，但从没有 将该PH的作用与样品稳定性相关联。
[0019] 概括来说，本发明组合使用不同的化学试剂以达到符合临床范围检测值的病原体 检出限（0. 1-lCFU/mL)。皂苷与PEG以及至少一种核酸酶的组合使用从没有被报道过，这允 许迄今为止尚未知晓的技术改进。对于制备用于鉴定或检测的分析样品来说，这些试剂的 组合可以是完整的（皂苷+PEG+核酸酶）或部分的（皂苷只加核酸酶或皂苷只加 PEG或只 有 PEG)。
[0020] 为了这个目的，本发明涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标微生物的方 法，所述液体生物样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括：
[0021] ?其细胞膜或衣壳不包含胆固醇的目标微生物，和
[0022] ?非靶标成分，即：
[0023] -其细胞膜包含胆固醇的非靶标细胞，和
[0024] -任选存在的，具有包含胆固醇的包膜的病毒，和
[0025] -任选存在的，包含胆固醇的支原体，和
[0026] -任选存在的，目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述方法包括以下步骤：
[0027] a)将液体生物样品与皂苷制剂接触，以便使包含胆固醇的细胞膜或包含胆固醇的 病毒包膜或包含胆固醇的支原体膜不稳定，
[0028] b)对非革El标细胞进行渗透压休克（osmotic shock)以便将它们特异性裂解，
[0029] c)添加能够裂解游离核酸（DNA和/或RNA)(来源于样品溶液中裂解的非靶标成 分）的至少一种酶的溶液，允许目标微生物被选择性获得。
[0030] 本发明还涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标微生物的方法，所述液体生 物样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括：
[0031] ?其细胞膜或衣壳不包含胆固醇的目标微生物，和
[0032] ?非靶标成分，即：
[0033] -其细胞膜包含胆固醇的非靶标细胞，和
[0034] -任选存在的，具有包含胆固醇的包膜的病毒，和
[0035] -任选存在的，包含胆固醇的支原体，和
[0036] -任选存在的，目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述方法包括以下步骤：
[0037] a)将液体生物样品与皂苷制剂接触，以便使包含胆固醇的细胞膜和/或包含胆固 醇的病毒包膜和/或包含胆固醇的支原体膜不稳定，
[0038] b)对非靶标细胞进行渗透压休克以便将它们特异性裂解，
[0039] c)添加用于沉淀样品溶液中未裂解目标微生物的试剂，允许目标微生物被选择性 获得。
[0040] 根据第三个实施方案，本发明涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标微生物 的方法，所述液体生物样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括：
[0041] ?其细胞膜或衣壳不包含胆固醇的目标微生物，和
[0042] ?非靶标成分，即：
[0043] -其细胞膜包含胆固醇的非靶标细胞，和
[0044]-任选存在的，具有包含胆固醇的包膜的病毒，和
[0045] -任选存在的包含胆固醇的支原体，和
[0046] -任选存在的，目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述方法包括以下步骤：
[0047] a)将液体生物样品与皂苷制剂接触，以便使包含胆固醇的细胞膜和/或包含胆固 醇的病毒包膜和/或包含胆固醇的支原体膜不稳定，
[0048] b)对非靶标细胞进行渗透压休克以便将它们特异性裂解，
[0049] c)添加用于沉淀样品溶液中未裂解目标微生物的试剂，和
[0050] d)添加能够裂解来源于样品溶液中裂解的非靶标成分的游离核酸（DNA和/或 RNA)的至少一种酶的溶液，允许目标微生物被选择性获得。
[0051] 最后提及的所述方法的步骤c)可以在步骤a)和b)之后或步骤d)后，不依赖于 步骤a)进行。
[0052] 本发明还涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标核酸的方法，所述液体生物 样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括：
[0053] ?其细胞膜或衣壳不包含胆固醇的目标微生物，和
[0054] ?非靶标成分，即：
[0055] -其细胞膜包含胆固醇的非靶标细胞，和
[0056] -任选存在的，具有包含胆固醇的包膜的病毒，和
[0057] -任选存在的，包含胆固醇的支原体，和
[0058] -任选存在的，目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述方法包括以下步骤：
[0059] a)将液体生物样品与皂苷制剂接触，以便使包含胆固醇的细胞膜和/或包含胆固 醇的病毒包膜和/或支原体膜不稳定，
[0060] b)对非靶标细胞进行渗透压休克以便将它们特异性裂解，
[0061] c)添加能够裂解来源于样品溶液中裂解的非靶标成分的游离核酸（DNA和/或 RNA)的至少一种酶的溶液，
[0062] d)将步骤（c)添加的酶失活，和
[0063] e)使未被步骤（C)的酶降解的目标微生物的核酸容易接近。
[0064] 根据第五个实施方案，本发明涉及一种在液体生物样品中选择性分离目标核酸的 方法，所述液体生物样品包括或可能包括，尤其包括或可能包括：
[0065] ?其细胞膜或衣壳不包含胆固醇的目标微生物，和
[0066] ?非靶标成分，即：
[0067] -其细胞膜包含胆固醇的非靶标细胞，和
[0068] -任选存在的，具有包含胆固醇的包膜的病毒，和
[0069] -任选存在的，包含胆固醇的支原体，和
[0070] -任选存在的，目标微生物和/或非靶标细胞的碎片，所述方法包括以下步骤：
[0071] a)将液体生物样品与皂苷制剂接触，以便使包含胆固醇的