富集短链核酸的方法
【专利说明】富集短链核酸的方法
[0001] 本发明专利申请是国际申请号为PCT/EP2006/069484，国际申请日为2006年12月 08日，进入中国国家阶段的申请号为200680046308. 3,名称为"富集短链核酸的方法"的发 明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及富集长度小于300个核苷酸的核酸的方法，涉及用于富集长度小于 300个核苷酸的核酸的试剂盒，涉及所述试剂盒的用途，涉及阴离子交换基质的用途并涉及 治疗疾病的方法。
[0003] 若干年前，由于发现小的核糖核酸（RNA)执行了基因表达的实质调节功能，因此 科学研究日益集中于短于300个核苷酸，尤其是短于100个核苷酸的小RNA。更具体地说， 许多研究者已经对微小RNA(miRNA)感兴趣。miRNA是一类在进化上保守的长度约22个核 苷酸的小的非编码RNA，其在调苄基因表达中的复杂作用正变得越来越明显。已在所研究的 所有真核生物和几乎所有组织中发现miRNA，其中包括真菌、植物、昆虫和哺乳动物。除了 miRNA，还已经发现其它小RNA在细胞功能中也扮演重要角色。这些小RNA包括，例如，小干 扰 RNA(siRNA)、核小 RNA(snRNA)和核仁小 RNA (snoRNA)。
[0004] 这些短于300个核苷酸的短RNA必须尽可能纯并以高产率从要研究的生物系统中 纯化，这样才能够研究它们的细胞作用。因此迫切需要提供能够从复杂生物系统、尤其从细 胞裂解物中纯化和分离这种短RNA的方法。
[0005] 通常，为分离生物样品中的核酸，必须将它们与剩余的细胞组分如蛋白质、糖类、 脂质和其它组分分离。现有技术已经披露了多种从非常不同的原料，如从细胞培养物、从植 物和动物来源的组织、以及从体液分离核酸的方法。例如，一种方法包括在有机溶剂如酚和 氯仿的帮助下提取通常为水性的原始溶液（Chomczynski和Sacchi，1987)，然后在醇类如 乙醇或异丙醇的帮助下从水相中沉淀核酸（Sambrook，J.，Fritsch，E. F. in T. Maniatis， CSH，"Molecular Cloning"，1989)。另一种方法包括将核酸固定于固相，例如通过娃吸附技 术。不利的是，所有这些方法不能、或不足以分离或至少纯化相对较小的核酸。
[0006] 为解决该问题，现有技术已经披露了专门富集小RNA群体的方法，该方法基于硅 膜技术。在这些方法中，在将细胞裂解之后在细胞裂解物中加入相对小量的醇，在离液结合 条件下至少部分相对较长的核酸可结合于硅膜。然而，现有技术所述纯化方法中所用醇的 量过低，因此不能使小核酸也有效结合于硅膜，因此这些小RNA出现在流出液中。然后提高 流出液的醇浓度，然后再结合第二硅膜。洗涤步骤之后，小RNA与未结合于第一柱的所有 其它核酸一起被洗脱（参见，例如，来自美国奥斯汀安拜恩公司（Ambion，Austin，USA)的 w/rVana?试剂盒或来自德国希尔登恰根公司（QIAGEN，Hilden，Germany)的RNeasy?脂组 织迷你试剂盒，使用方法见〃使用手册〃）。
[0007] 恰根与安拜恩法的缺点在于需要使用两种固相，且通过单次结合步骤无法仅获得 所需的小RNA。此外，例如，如果不同时分离tRNA和其它较大核酸，则该方法无法分离大小 约22个核苷酸的miRNA。尽管在某些条件下通过该方法可以富集小RNA，尤其是miRNA达 到一定程度，但所述小RNA仍会被其它核酸尤其被转运RNA (tRNA)污染。
[0008] 本发明的目的是克服现有技术的缺点。
[0009] 更具体地说，本发明的目的是提供一种富集（enrich)小核酸，尤其是miRNA的方 法，例如，该方法能够采用尽可能少的方法步骤从复杂的生物组合物如细胞裂解物中富集 小核酸。
[0010] 本发明的再一个目的是提供一种纯化小核酸的方法，例如，该方法不仅能够从复 杂生物组合物如细胞裂解物中长度大于300个核苷酸的核酸或其它组分中除去长度为25 个核苷酸或更小的特定核酸，还能够从长度小于300且大于25个核苷酸的其它核酸如tRNA 中特异性除去这些小核酸。
[0011] 本发明还提供了一种可用于尽可能单独产生所需大小的RNA的方法。
[0012] 本发明的再一个目的是提供一种无需改变反应容器的方法一通过"单容器反应 (one-pot reaction) " 一从而将待分析样品的混合风险降至最低。
[0013] 本发明的再一个目的是提供一种试剂盒，在该试剂盒的帮助下能够如上所述从复 杂生物组合物中有利地纯化小核酸，尤其是小RNA。
[0014] -种富集长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100个核苷 酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸的方法为解决一开始提到的问 题做出了贡献，所述方法包括以下步骤：
[0015] i)提供流体相（fluid phase)，优选水相P1，其中含有
[0016] ( α 1)至少一种长度小于300个核苷酸，优选小于200个核苷酸，更优选小于100 个核苷酸，再优选小于50个核苷酸，最优选小于25个核苷酸的核酸，和
[0017] ( α 2)至少一种不同于所述核酸（α 1)的组分，
[0018] ii)使所述相P1接触阴离子交换基质以使所述核酸（α 1)结合于阴离子交换基 质，
[0019] iii)任选地用洗涤缓冲液洗涤所述阴离子交换基质，其中所述核酸（α 1)仍旧结 合于阴离子交换基质，和
[0020] iv)从所述阴离子交换基质上除去，优选洗脱，结合于阴离子交换基质的核酸 (α 1)以获得含有核酸（α 1)的流体相，优选水相P2。
[0021] 令人惊奇地发现通过与阴离子交换基质结合然后再洗涤和洗脱，而不需要上述恰 根和安拜恩法所需的首先稀释较长核酸，便可从除所述小核酸外可能含有众多其它组分的 复杂生物组合物中富集长度小于300个核苷酸的小核酸。
[0022] 根据本发明方法的一个优选实施方式，要纯化的核酸（α 1)是单链或双链RNA，优 选双链RNA。更具体地说，优选的长度小于300个核苷酸的RNA是选自下组的RNA :miRNA， 前 miRNA，siRNA，snRNA，snoRNA，tRNA，5S-rRNA，5. 8S-rRNA 或其中至少两种的混合物，尤其 是miRNA和tRNA的混合物，更优选的核酸（α 1)是miRNA，其长度在15-30个核苷酸之内， 再优选为17-24个核苷酸，最优选其长度为20-23个核苷酸。
[0023] 术语"5S-rRNA"和"5. 8S-rRNA"表示可在真核核糖体内发现的非编码核糖核酸。 术语"tRNA"表示由约80个核苷酸构成并含有共辄碱基对（腺嘌呤和尿嘧啶；胞嘧啶和鸟 嘌呤）的核糖核酸。这些碱基对造成了 tRNA苜蓿叶样结构。术语"siRNA"表示长度约为22 个核苷酸的核糖核酸，它是通过酶"切割机"切割双链RNA (dsRNA)并掺入"RISC"(RNA-诱导 的沉默复合体）酶复合体而产生的。术语"snRNA"表示真核生物细胞核内大小约100-300 个碱基对的催化活性RNA。这些snRNA通常与蛋白质结合形成"snRNP"（核小核糖核蛋 白）并负责剪切掉前mRM中的内含子以得到mRNA。术语"snoRNA"表示一类涉及核糖体 RNA(rRNA)和其它RNA基因的化学修饰，如甲基化的核糖核酸。它们形成"snoRNP"（核仁 小核糖核蛋白）的一部分。术语"miRNA"表示用于调节植物和动物发育过程的小核酸。它 们特异性结合mRNA并阻止后者在翻译中的活性，例如防止过量产生生长因子。miRNA是从 双链前体产生的单链RNA分子。
[0024] 不同于长度不超过300个核苷酸的核酸（α 1)的组分（α 2)是长度至少为300个 核苷酸的特定核酸（α 2'）和不同于核酸的组分（α 2〃）。
[0025] 长度至少为300个核苷酸的核酸（α 2'）具体包括单链或双链DNA分子或者单链 或双链 RNA 分子，例如 mRNA、18S-rRNA 或 28S-rRNA。
[0026] 不同于核酸的组分（α 2〃）具体是指细胞裂解过程中释放的那些组分。因此，这些 组分具体包括蛋白质、脂质、多肽或多糖。
[0027] 方法步骤i)中提供的流体相，优选水相P1可以是不含细胞的样品材料、血浆、血 清、体液（如血液、尿液、精液、唾液、脑脊髓液、痰液）、表面活检样品、废水、淤泥或细胞裂 解物（如来自动物或植物组织、来自微生物如细菌、真菌或酵母、来自组织培养物或细胞培 养物、或者来自体液如血液的细胞裂解物）。
[0028] 根据本发明方法的一个【具体实施方式】，方法步骤i)中提供的流体相，优选水相P1 是通过包括以下步骤的方法获得的细胞裂解物：
[0029] I)提供细胞，
[0030] II)裂解细胞以获得细胞裂解物，和
[0031] III)任选地从所述细胞裂解物中至少部分地分离至少一种不同于核酸（a J的组 分（α 2)。
[0032] 方法步骤I)中提供的细胞可以是任选固定的组织切片或任选固定的组织片段、 贴壁培养细胞、悬浮培养细胞或者是体液中的细胞。
[0033] 如果细胞是贴