基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测的制作方法
【专利摘要】本发明涉及利用包含探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验的核苷酸变异检测的新的方法及试剂盒。并且，本发明提供利用包含具有非-碱基对部分的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列检测核苷酸变异的新的方法及试剂盒。
【专利说明】基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列 的核苷酸变异检测 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸（PTOCE，PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验的从祀核酸序列的核苷酸变异检测。 【【背景技术】】
[0002] DNA杂交（hybridization)是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、 核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特 定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分 析。
[0003] 但是，在仅依赖杂交的现有的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的 非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，现有的方法以及过程存在改善可靠 性的问题。
[0004] 除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqMan?探针方 法。
[0005] 在TaqMan?探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游引物-依赖性 DNA聚合酶的5'核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号（美国专利第5210015 号、第5538848号以及第6326145号）。TaqMan?探针方法提出用于信号产生的两个接近 法：聚合-依赖性切割（polymerization-dependent cleavage)以及聚合-独立性切割 (polymerization-independent cleavage)。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须 在核酸聚合酶与标记探针的5' -末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地 切割标记探针的5'-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与 靶核酸序列进行杂交，上游引物的3' -末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记 探针的5' -末端接触来放出标记。并且，TaqMan?探针方法公开，通过在其5' -末端部位 具有不与靶序列杂交的5' -尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5' -尾巴区域的片段。
[0006] 也有对具有对靶序列非-互补的5'-尾巴区域的探针被5'核酸酶切割，放出包含 5' -尾巴区域的片段的几种方法的报告。
[0007] 例如，美国专利第5691142号就公开了对基于DNA聚合酶的5'核酸酶活性来被切 割的切割结构。公开中例示了有对包含对模板非-互补的5'部位以及对模板互补的3'部 位的寡核苷酸与模板杂交，并且，上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的 切割结构。切割结构通过被具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶或具有减少的合成活性的变 形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5'部位。之后，被放出的5'部位与具有发夹 结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
[0008] 美国专利第7381532号公开了具有3'-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通 过被具有5'核酸酶活性的DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶切割，来放出非-互补的5'皮瓣 (flap)部位，被放出的5'皮瓣部位基于大小分析或相互作用性双重标记来被检测的过程。 美国专利第6893819号公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒 介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成 依赖性方式切割第二个切割结构来从第二个切割结构放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。美 国专利第7309573号公开了包括基于核酸合成生成的被放出的皮瓣的生成、被放出的皮瓣 的延伸、在皮瓣延伸期间的寡核苷酸的切割及切割寡核苷酸而生成的信号检测的方法。
[0009] 借助液相中的荧光-标记探针的杂交，即使利用一种荧光标记，也能够基于解链 曲线分析来同时检测多个靶核酸序列。但是，在基于相互作用性-双重标记探针的5'核酸 酶介导的切割来检测靶序列的现有技术中，在检测多重靶时，对相互不同的靶序列需要相 互不同的种类的荧光标记，由于这种荧光标记的种类数量有限，因而检测出的靶序列的数 量受限。
[0010] 美国申请
【发明者】千钟润, 李荣祚 申请人:Seegene株式会社