具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸的制作方法
【专利说明】具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸
[0001] 发明背景
[0002] 本发明涉及可结合互补RNA的寡聚物和寡核苷酸。寡核苷酸在科学、研宄和开发 中可用作试剂，例如用于检测和分析细胞RNA或用于调节细胞RNA的活性。
[0003] 寡核苷酸也正被开发为治疗剂，其中，它们通常还旨在结合并调节细胞RNA的活 性。结合细胞RNA的寡核苷酸在本文中也称为反义寡核苷酸。
[0004] 一些反义寡核苷酸通过诱导它们的靶RNA去稳定（例如通过激活靶RNA的RNA酶 H降解或通过激活RISC途径）来起作用。这样的寡核苷酸通常分别被描述为gapmers和 SiRNA。另一类寡核苷酸用作空间阻断剂，从而防止靶RNA与另一大分子相互作用。一个实 例是剪接转换寡核苷酸，其调节mRNA前体的剪接。另一个实例是结合微小RNA并防止微小 RNA结合其靶mRNA的微小RNA抑制剂。反义寡核苷酸的设计、制备和用途的详尽描述可见 于〃Antisense Drug Technology, Principles, Strategies and Applications，第 2 版，由 Stanley Crooke 编辑〃中。
[0005] 很容易设计与给定的靶RNA互补、从而能够结合所述靶RNA的反义寡核苷酸。然 而，当试图将反义寡核苷酸开发为治疗剂时，对靶的互补性是不够的。反义寡核苷酸需要进 行修饰，以赋予其更多类似药物的性质，例如更好的效力、生物利用度和生物稳定性。此外， 已经证明，许多反义寡核苷酸的问题是脱革El结合（off-target binding)，即结合于非目标 的RNA，这可能导致不期望的效应。为了最大限度地减少脱靶结合，通常试图将其靶向RNA 转录组中的独特序列。即便如此，反义寡核苷酸的脱靶结合仍是一个问题。本发明的一个 目的是提供反义寡核苷酸，特别地在脱靶结合方面具有新的和期望的特征的空间阻断寡核 苷酸。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了可结合RNA的寡聚物，其由如下部分组成：
[0008] ?更低亲和力区域，
[0009] ?更高亲和力区域，
[0010] ?其中所述更高亲和力区域中的单体相较于所述更低亲和力区域中使用的单体而 言以更高的水平提高与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度（即亲和力），其中所述解链温度 的升高是相对于变通使用相同（碱基）序列的DNA单体而言的。
[0011] 本发明的寡聚物可用于结合靶RNA，诸如mRNA和非编码RNA，并且具有这样的有利 方面：它们通过所述更低亲和力区域的脱靶结合相较于通过所述更高亲和力区域而言更不 容易。
[0012] 附图概述
[0013] 图1显示了结合于其目标靶（中靶（the on-target))的典型的空间阻断低聚物 (steric block oligomer)。共有序列是与其它RNA共享的序列，并且优选地为细胞分子例 如微小RNA上的结合位点的部分。与共有序列相邻的序列被指定为独特1，并且是在共享该 共有序列的RNA之间不同（在本文中也被称为"特异性序列"）的序列。碱基对由寡聚物与 靶之间的线指示。用增强对互补RNA的亲和力的单体类似物均匀地修饰寡聚物，这些修饰 的位置通过指向靶的粗体（碱基对）线显示。寡聚物可以例如是BNA/2'O-甲基RNA寡聚 物，亲和力增强性类似物则是BNA(双环核酸）。图示设计可以也只是在每第三位置或甚至 所有位置上是亲和力增强性类似物或任何其它重复模式，这在寡聚物的整个长度上提供了 相对均匀的亲和力。很显然，G:C碱基对比A:U碱基对更强。然而，为了简单起见，在本实 例中不考虑这样的序列特异性亲和力变化。
[0014] 图IB显示具有与图IA的寡聚物A相同的序列，但结合其目标靶的亲和力增强性 修饰非均匀分布的空间阻断寡核苷酸。该寡聚物对互补RNA的亲和力将不会与IA的寡聚 物显著不同。取决于选择的单体，总体亲和力可以更高或更低。
[0015] 图IC显示具有与图IA的寡聚物A相同的序列、但结合其目标靶的亲和力增强性 修饰非均匀分布的另一个空间阻断寡核苷酸。该寡聚物对互补RNA的亲和力将不会与IA 或IB的寡聚物显著不同。取决于选择的单体，总体亲和力可以更高或更低。
[0016] 理论上，所有3种寡聚物对互补RNA具有相似的亲和力，从而预期可具有相似的效 力，例如当在细胞或生物体中使用时。然而，它们具有不同的脱靶特征（结合不同组的脱 靶）。
[0017] 图2显示与图1中举例说明的相同的、然而结合与目标靶共享共有序列的脱靶 (off target)的寡聚物。
[0018] 2A中的寡聚物对脱靶将具有中等的亲和力，然而2B中的寡聚物对脱靶将具有减 小的亲和力，因为与共有序列互补的区域是"更低亲和力区域"，如通过亲和力增强性修饰 (诸如BNA)的更低密度看到的。即，所述B寡聚物不太可能结合包含所述共有序列的脱靶。
[0019] 然而，在另一方面，C寡聚物更可能结合包含共有序列的脱靶，因为其通过其"更高 亲和力区域"进行该结合。
[0020] 图3显示与图1和2中举例说明的相同的、然而结合不共享共有序列的脱靶的寡 聚物。可看到寡聚物B将最高效地结合所述脱靶，因为其通过其更高亲和力区域结合，而寡 聚物C最低效地结合所述脱靶，因为其通过其更低亲和力区域结合。即，寡聚物B对共享共 有序列的RNA靶的增强的特异性以对包含所述特异性区域的RNA靶的特异性降低为代价来 实现。
[0021] 本发明的公开内容
[0022] 本发明提供了用于靶向RNA例如mRNA和非编码RNA的寡聚物。
[0023] 本发明的第一方面是结合包含如下区域（或更优选由如下区域组成）的10-40个 单体的寡聚物：
[0024] ?更低亲和力区域，
[0025] ?更高亲和力区域，
[0026] ?其中所述更高亲和力区域中的单体（一起）相较于所述更低亲和力区域中使用 的单体（一起）升高与互补RNA碱基配对的寡聚物的解链温度（即亲和力），其中所述解链 温度的升高是相对于相同（碱基）序列的DNA单体的变通使用而言的，
[0027] ?并且其中所述更低亲和力区域或更高亲和力区域具有5-12个连续单体，诸如 5-10, 5-9, 5-8, 6-10, 7-10, 8-10, 6-9或6-8个连续单体，并且其中另一个区域毗邻5-12个 单体的区域侧翼连接的两个子区域或由其组成。
[0028] 应当理解，当上文中提及"更高亲和力区域中的单体"和"更低亲和力区域中使用 的单体"时，指的是所述区域中的单体一起而非单个的单体。因此，并非所述更高亲和力区 域中的每一个单体相较于所述更低亲和力区域中使用的单个单体而言一定会升高解链温 度。
[0029] 优选地，更高亲和力区域中的单体（一起）相较于更低亲和力区域中使用的单体 而言使与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度（即亲和力）升高至少5°C，诸如至少5°C、 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C，其中所述解链温度的升高是相对于变通使用相同 序列的DNA单体而言的。
[0030] 当提及与RNA碱基配对的寡聚物的解链温度（在本文中也称为tm或tm值）时， 优选在 IOOmM NaCl, 0· ImM EDTA, IOmM NaH2PO4, 5mM Na2HPO4, pH 7. 0 中，使用 L 0 μ M浓度的 寡聚物和互补RNA测量所述温度。
[0031] 在一个优选实施方案中，所述更高亲和力区域中的单体相对于所述更低亲和力区 域中的单体而言平均起来（每单体）升高解链温度。即，将更低和更高亲和力区域的tm的 升高分别除以所述更低和更高亲和力区域中的单体的数目。应当指出，更低亲和力区域的 tm的升高可以是负的，当tm相对于变通使用相同序列的DNA单体而言降低时情况即如此。
[0032] 优选地，更高亲和力区域中的单体相较于更低亲和力区域中的单体平均起来（每 单体）使解链温度升高至少2°C，诸如3°0、4°0、5°0、6°0、7°0或8°〇。
[0033] 所述寡聚物通常是寡核苷酸，并且优选包含至少2种不同类型的单体，所 述单体例如选自DNA、RNA、BNA(具体地2'，4' -二环核酸（2' 4' -BNA)诸如ENA和 LNA (2' -0, 4' -C-亚甲基-β -D-呋喃