一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源rna机制的lna寡核苷酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应 的基于竞争性内源RNA机制的LNA寡核苷酸。
【背景技术】
[0002] 癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体 存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功 能基因组学研宄的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA，然而，对于 长非编码RNA(lncRNA)在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少（XieC，Yuan J，LiH，LiM，ZhaoG，BuD，etal.N0NC0DEv4:exploringtheworldoflongnon-coding RNAgenes.Nucleicacidsresearch. 2013.)〇
[0003] 除了蛋白质编码基因，人类基因组制造了大量的非编码RNA，包括microRNA和 IncRNAs。microRNA和IncRNA在调节细胞过程方面都有着至关重要的作用，如细胞的生长 和凋亡，以及癌症的进展和转移。虽然众所周知microRNA可以靶向大量的蛋白质编码基 因，但少有人知道IncRNA可以靶向大量的蛋白质编码基因，更少有人知道IncRNA是否也可 以革巴向microRNA。
[0004] 期刊文献（ZhangZ，ZhuZ，WatabeK,ZhangX，BaiC,XuM，WuF,MoYY. (2013) NegativeregulationofIncRNAGAS5bymiR-21.CellDeathDiffer. 2013.)通过基因 筛选方法，使用IncRNART-PCR(反转录-聚合酶链反应）Array方法，表明miR-21能够抑制 IncRNA生长抑制特异性因子5 (GAS5)。miR-21和GAS5的负相关关系也见于乳腺肿瘤标本。 有趣的是，GAS5也能够抑制miR-21的表达。过表达GAS5抑制miR-21表达，GAS5-siRNA 增加miR-21的表达。更重要的是，有一个假定的miR-21的结合位点位于GAS5外显子4 ; miR-21结合位点缺失能够删除活性。体外细胞培养和异种移植小鼠模型的实验表明GAS5 是作为肿瘤抑制子发挥作用。结果还表明，生物素标记的GAS5-RNA探针能够PullDown RNA诱导的沉默复合物（RISC)的关键蛋白（AG02)，并且miR-21包含在GAS5-RISC复合物 中，这意味着miR-21和GAS5以相互调节方式，通过革E1向microRNA介导基因沉默。所以， IncRNAGAS5可以靶向抑制肿瘤蛋白编码基因，而且可以通过靶向miR-21发挥抗肿瘤作 用。重要的是，miR-21是目前被证明的重要的肿瘤促生长因子，已经被证明在多种肿瘤中表 达显著上调，并促进肿瘤增殖、侵袭及转移（文献1:ZhangZ，ZhuZ，WatabeK，ZhangX，Bai C,XuM,ffuF,MoYY. (2013)NegativeregulationofIncRNAGAS5bymiR-21.CellDeath Differ. 2013?文献2:SchetterAJ,LeungSY,SohnJJ,ZanettiKA,BowmanED,Yanaihara Netal.MicroRNAexpressionprofilesassociatedwithprognosisandtherapeutic outcomeincolonadenocarcinoma.JAMA2008;299:425 - 436?文献 3:JiangJ,Gusev Y,AdercaI,MettlerTA,NagorneyDM,BrackettDJetal.AssociationofMicroRNA expressioninhepatocellularcarcinomaswithhepatitisinfection,cirrhosis,and patientsurvival.ClinCancerRes2008;14:419 - 427. )，GAS5 则相反，GAS5 为肿瘤抑 制因子，且在促进肿瘤细胞凋亡等方面发挥作用。GAS5与miR-21之间通过竞争性内源RNA 调节机制发挥作用，这对于进一步研宄IncRNA与microRNA参与的基因表达调控网络在肿 瘤发病及进展中具有重要的意义，同时为肿瘤的治疗提供了一条重要途径，而目前还未见 基于GAS5与miR-21的竞争性内源RNA调节机制治疗肿瘤的报道。
[0005] 锁核酸（lockednucleicacid，LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研宄 领域引起了人们的广泛关注，有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口。它是一种特 殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有2' -0,4' -C-亚甲基-0-D-呋喃核糖核酸单体， 核糖的2' -0位和4' -C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基 桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧 性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸 盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种LNA寡核苷酸。
[0007] 本发明的再一的目的是，提供所述的LNA寡核苷酸的用途。
[0008] 本发明的另一的目的是，提供一种缀合物。
[0009] 本发明的第四个目的是，提供一种药物组合物。
[0010] 本发明的第五个目的是，提供所述的缀合物或药物组合物的用途。
[0011] 本发明的第六个目的是，提供一种试剂盒。
[0012] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
[0013] LNA寡核苷酸，所述的LNA寡核苷酸由下述序列组成：A+T+T+ACAGGCATTAGACAGA+A AGCTG+G+T+C，其中+选自0 -D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。
[0014] 优选地，所述的LNA寡核苷酸选自下述序列的一种：
【主权项】
1. LNA寡核苷酸，其特征在于，所述的LNA寡核苷酸由下述序列组成：A+T+T+ACAGGCATT AGACAGA+AAGCTG+G+T+C，其中+选自0-D-氧-LNA核苷酸类似物中的任一种。
2. 根据权利要求1所述的LNA寡核苷酸，其特征在于，所述的LNA寡核苷酸选自下述序 列的一种： a) AGTCTAACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTCC ； b) AGTCTAACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTCC ； c) AGTATCACAGGCATTAGACAGATAAGCTGAGCTAC ； d) AGTATCACAGGCATTAGACAGAGAAGCTGAGCTAC, 其中，S为G-0 -D-氧-LNA核苷酸类似物，￡为C-0 -D-氧-LNA核苷酸类似物，A为 A- 0-D-氧-LNA核苷酸类似物，I为T- 0-D-氧-LNA核苷酸类似物。
3. 权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸在制备药物中的应用，其特征在于，所述的药物 用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的miR-21表达显著上调的疾病选自 miR-21表达显著上调的肿瘤和血管发生。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的miR-21表达显著上调的肿瘤选自 前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌和结肠癌。
6. -种缀合物，其特征在于，所述的缀合物包含权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸， 和至少一个共价结合到所述LNA寡核苷酸上的非核苷酸或非多核苷酸部分。
7. -种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1或2所述的LNA寡 核苷酸，以及可药用的稀释剂、载体或辅剂。
8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含水性载体， 所述的水性载体包含用于将pH维持在7. 35-7. 45范围内的缓冲剂。
9. 权利要求6所述的缀合物或权利要求7所述的药物组合物在制备药物中的应用，其 特征在于，所述的药物用于治疗或诊断miR-21表达显著上调的疾病。
10. -种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1或2所述的LNA寡核苷酸， 以及适合重配所述LNA寡核苷酸的盐水或缓冲溶液。
【专利摘要】本发明涉及一种具有抗肿瘤及放化疗增敏效应的基于竞争性内源RNA机制的LNA寡核苷酸。本发明基于lncRNA GAS5与miR-21之间存在的竞争性内源RNA调节机制，设计了靶向miR-21的修饰性LNA寡核苷酸，其特异性强、稳定性好，经体外实验和动物实验证实该LNA寡核苷酸能降低miR-21的表达，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，效果十分显著，且具有放化疗增敏效应，因此可用于治疗miR-21增高的相关疾病，如靶向阻断miR-21增高相关肿瘤的增殖、复发和转移，抑制血管发生等，还可用于提高临床的放化疗效果以及临床miR-21相关疾病的诊断和预防等。
【IPC分类】A61P35-00, C12N15-113, C12Q1-68, A61K31-713
【公开号】CN104531711
【申请号】CN201510005015
【发明人】张子强, 朱竹先, Y·莫, 邱忠民, 吕寒静
【申请人】上海市同济医院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月4日