一种针对miR?103?3p反义寡聚核苷酸及应用
【专利摘要】本发明属于药物制备领域，具体涉及一种针对miR?103?3p反义寡聚核苷酸。所述的针对miR?103?3p反义寡聚核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的针对miR?103?3p反义寡聚核苷酸可以用于制备治疗蛛网膜下腔出血的药物。本发明所提供的针对miR?103?3p反义寡聚核苷酸毒性小，能够改善蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。
【专利说明】
一种针对m i R-103-3p反义寡聚核苷酸及应用
技术领域
[0001] 本发明属于小分子生物药物领域，涉及一种针对miR-103-3p反义寡聚核苷酸及应 用。
【背景技术】
[0002] 蛛网膜下腔出血（SAH)是指脑底部或脑表面血管破裂后，血液流入蛛网膜下腔引 起相应临床症状的一种脑卒中，又称原发性蛛网膜下腔出血。SAH约占全部脑卒中的5%-10%，年发病率约6-20/10万人。
[0003] SAH的常见原因有先天性动脉瘤、脑血管畸形、脑底异常血管网病(moyamoya病）以 及夹层动脉瘤、血管炎、高血压动脉硬化等。血液进入蛛网膜下腔，通过围绕在脑和脊髓周 围的脑脊液迅速播散，刺激脑膜引起脑膜刺激征。颅内容量增加引起颅内压升高，甚至脑 疝。在脑室和脑地凝固的血液可阻塞脑脊液循环通路，使其吸收和回流受阻引起梗阻性脑 积水，或引起蛛网膜粘连，后交通动脉瘤的扩张或破裂出血可压迫邻近的动眼神经，产生不 同程度的动眼神经麻痹。血细胞释放的血管活性物质可引起血管痉挛，严重者发生脑梗死。 血液刺激下丘脑可引起血糖升高、发热等内分泌和自主神经紊乱。SAH在30天内病死率约为 25%或更高。再出血的病死率为50%，2周内再出血率为20%-25%。影响SAH患者预后的的 主要因素是早期脑损伤和血管痉挛导致的迟发型脑损伤等并发症。目前临床上SAH的治疗 手段十分有限，仅有一般处理和对症治疗、降低颅内压、防治再出血。对于早期脑损伤，尚缺 乏有效的治疗策略。
[0004] MicroRNAs(miRNAs)为一类长度为18-25个核苷酸的短链非编码RNA，在体内可与 目的基因 mRNA的3'UTR互补结合从而抑制目的基因的表达。从药物开发的角度来看， MicroRNAs具有序列已知且短小，通常在物种间完全保守等显著优势。近年来越来越多的动 物实验甚至临床试验表明疾病相关microRNAs的抑制剂反义寡聚核苷酸有望成为一种全新 的药物。反义寡聚核苷酸是人工合成的一小段寡核苷酸，其可以与成熟的microRNAs互补结 合从而阻止microRNAs与目的基因 mRNA相互作用。为了实现对疾病相关microRNAs进行有效 抑制，反义寡聚核苷酸需经过一系列的化学修饰其中包括硫代磷酸骨架修饰，高亲和力二 糖修饰以及胆固醇修饰。这些化学修饰使得反义寡聚核苷酸的核酸酶抵抗力，细胞摄取力 及其与目的基因的亲和力均大大提高了，从而能有效的在体内发挥抑制作用。反义寡聚核 苷酸也有可能绑定其他相似序列造成脱祀现象(off-target effects)，从而引起无法预料 的后果。其真实药效情况如何，既往并无研究证据。
[0005] miR-103_3p又称低氧诱导microRNA，属于miR-15/107家族成员。多种芯片信息表 明miR-103-3p在中枢神经系统中高度表达且在卒中后表达进一步上调，预示着其对于中枢 神经系统基因表达调控有着重要的作用。有研究显示，miR-103-3p与中枢神经系统中将近 20%的mRNA有着高度重叠。目前已报道抑制miR-103-3p表达的慢病毒载体对胰腺癌细胞的 表达有抑制作用。但尚未见抑制miR-103-3p表达对脑血管病变有疗效的报道。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种针对miR-103-3p反 义寡聚核苷酸。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供上述miR-103-3p反义寡聚核苷酸的应用。
[0008]本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] -种针对m i R - 1 〇 3 - 3 p反义寡聚核苷酸的核苷酸序列如下：5'_ TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT-3'（SEQ ID N0.1)。
[0010] 所述的针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸优选经过5'端胆固醇修饰和3'端甲基 化修饰。
[0011]本发明所述的针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸在制备治疗脑血管病的药物中 的应用。
[0012] 所述的脑血管病优选治疗蛛网膜下腔出血、蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。
[0013] 一种用于治疗脑血管病的药物，包括药理学有效剂量的本发明所述的针对miR-l〇3-3p的反义寡聚核苷酸以及药理学可接受的载体。
[0014] 所述的脑血管病优选蛛网膜下腔出血、蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。
[0015] 所述的载体描述了对有机体不造成明显刺激并且不消弱miR-103-3p反义寡聚核 苷酸生物活性和性能的物质。载体必须有足够的纯度和足够低的毒性，以使其适合施用至 正在治疗的对象。载体可以是惰性的，或它可以具有药学益处。
[0016] miR-103-3p反义寡聚核苷酸和所述的载体可被制备成脂质体、纳米材料、微乳液、 微球、凝胶或囊泡等剂型。这些剂型的制备方法和所用的辅料均为现有技术。
[0017] 有益效果：
[0018]本发明通过实验发现，一定浓度的miR-103-3p反义寡聚核苷酸能够改善蛛网膜下 腔出血后的早期脑损伤，包括改善血脑屏障的破坏，降低神经元的死亡和凋亡，进而对脑组 织起到保护作用，可用于制备治疗蛛网膜下腔出血的药物。
[0019] 相对于其他miRNAs抑制剂，本发明提供的针对miR-103-3p反义寡聚核苷酸具有分 子量小，毒性小，稳定性及细胞摄取率高等优点，可用于脑血管疾病的实验治疗研究，有一 定的药物开发前景。
【附图说明】
[0020]
[0021] 图1为假手术组、反义寡聚核苷酸阴性对照组(简称阴性对照组，下同）、miR-103_ 3p反义寡聚核苷酸组(简称反义寡聚核苷酸组，下同）建模后miR-103-3p表达情况的比较。 图2为在出血量严重程度评分时对脑底基底池的具体分区。
[0022] 图3为假手术组、反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103_3p反义寡聚核苷酸组建模 后脑基底池出血量严重程度评分的比较。
[0023] 图4为假手术组、反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103_3p反义寡聚核苷酸组建模 后24h血脑屏障破坏程度比较结果。
[0024] 图5为假手术组、反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103_3p反义寡聚核苷酸组建模 后1，3,7，14,28天的行为学的比较。
【具体实施方式】 [0025] 实施例1
[0026] 1 方法
[0027] 1.1实验动物
[0028] 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠300_350g，由南京军区南京总医院动物实 验中心提供，术前单笼饲养3天，以避免非特异性因素的影响，饲养于室温20±2°C，12小时 光照/12小时黑暗环境中，保证自由饮食饮水。
[0029] 1.2实验方法
[0030] 1.2.1动物分组
[0031] 将SD大鼠随机分为假手术组（Sham)、反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103-3p反 义寡聚核苷酸组。
[0032] (1)假手术组:线栓插入颅内，但并不刺破血管；
[0033] (2)反义寡聚核苷酸阴性对照组：SAH建模前24h，按照0.2nmo 1/uL(总共5uL)，以 luL/10min经侧脑室给予反义寡聚核苷酸阴性对照， 3'（SEQ ID NO.2)同样经过5'端胆固醇修饰和3'端甲基化修饰的寡聚核苷酸，但是不具有 抑制miR-103-3p的功能。
[0034] (3)miR-103-3p反义寡聚核苷酸组：SAH建模前24h，按照0.2nmol/uL(总5uL)，以 luL/10min经侧脑室给予miR-103-3p反义寡聚核苷酸。
[0035] 1.2.2 SAH模型制备
[0036] 用10%水合氯醛将大鼠麻醉达适宜状态后，仰卧位固定于鼠板，以颅内血管穿刺 法建立大鼠 SAH模型。大鼠颈部备皮并消毒，解剖并充分暴露出右侧颈总、颈内、颈外动脉， 结扎颈外动脉和颈总近心端，并在颈内动脉起始处预留一根线，在两个结之间的颈总动脉 上用显微手术剪剪一个小口，用手术镊持带有尖端的4-0线栓通过颈总上的小口缓慢插入， 经颈内动脉入颅，直到感觉到阻力后再将线栓向前3mm以刺破大脑前和中动脉的分支处。刺 破后立即将线栓抽出，将颈内动脉结扎，即成功建造大鼠 SAH模型。假手术组的大鼠，在线栓 缓慢入颅后感觉到阻力即撤出，并不刺破血管。术中、术后都注意大鼠的保温以及随后能自 由饮食饮水，直到取脑安乐死。
[0037] 1.3实时荧光定量PCR测定miR-103-3p的表达量
[0038]引物由上海杰瑞公司合成，m i R - 1 〇 3 - 3 P逆转录引物：5 ' CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATAG 3'（SEQ ID 腸.3)，上游引物：5' ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGGC 3 ' ( SEQ ID NO · 4 )，下游弓| 物^-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 '（ SEQ ID NO · 5);内参U6:上游引物：5 ' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '（ SEQ IDN0·6)，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQIDN0·7)。取正常或SAH术后大鼠 右侧半球脑组织，用TRIzol提取组织总RNA并测定RNA浓度。取200-400ng的RNA为模板，使用 逆转录试剂盒(Thermo)逆转录成cDNA，PCR反应体系为25ul，cDNA 2ul，上游引物0.5ul，下 游引物0.5ul，SYBR混合液12.5ul，采用两步法PCR反应，反应条件:预变性95度X 30s，1个循 环;变性95度X 15s，退火加延伸60度X 30s，46个循环。反应结束后计算机自动结算结果，结 果以表示。
[0039] 1.4 SAH严重程度评分测定
[0040] 各组大鼠造模后24h取脑，将脑底拍照，在照片中，将基底池分为6个部分（图1)，然 后按照表1的评分标准进行评分。
[0041 ] 表1 SAH后出血严重程度评分标准
[0042]
[0043] 1.5大鼠神经功能评分
[0044] 在建模1，3，7，14，28天后进行大鼠运动感觉功能评分(如表2)。
[0045] 表2大鼠运动感觉神经功能评分标准
[0046]
[0047] 1.6 Evans Blue法检测血脑屏障通透性
[0048] 各组大鼠建模后24h，按5ml/kg的剂量经尾静脉注射2%Evans blue生理盐水溶 液，循环60分钟后，进行心脏灌注，取脑后将脑组织分为左右半球，并分别称量左右半球的 重量(g)，分别加入3ml甲酰胺，然后置于60°C水浴箱中24h后取出，在620nm下测吸光度值， 计算出左右半球的EB含量(ug)，EB的含量/脑组织重量(ug/g)即代表血脑屏障被破坏程度。
[0049] 2统计学分析
[0050] 本实验所有数据均使用均数土标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件，行单因素方 差分析或t检验，P〈0.05为差异有统计学意义。
[0051 ] 3 结果
[0052] 3.1 miR-103-3p反义寡聚核苷酸能够明显抑制SAH术后miR-103-3p表达。
[0053] 如图1所示miR-103-3p反义寡聚核苷酸组相对于反义寡聚核苷酸阴性对照组，SAH 术后24h miR-103-3p表达显著下调（P〈0.01) AAH术前24h侧脑室给予0.2nmol/uL(总共 5uL)的miR-103-3p反义寡聚核苷酸可显著抑制miR-103-3p的表达。
[0054] 3.2 SAH严重程度情况
[0055] 假手术组脑基底池并无出血，而反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103_3p反义寡 聚核苷酸组脑基底池出血严重程度之间并没有显著差异(P>〇.〇5)(如图3)。
[0056] 3.3血脑屏障通透性改变
[0057] 伊文思蓝染料渗透试验可显示血脑屏障的通透性，伊文思蓝渗出越多说明血脑屏 障损伤越严重。相对于假手术组，反义寡聚核苷酸阴性对照组、miR-103-3p反义寡聚核苷酸 组血脑屏障的均有不同程度的破坏，但是相比于反义寡聚核苷酸阴性对照组，miR-103-3p 反义寡聚核苷酸组伊文思蓝染料的渗出明显减少(P〈〇.01)。（如图4)
[0058] 3.4神经行为学改变
[0059] 大鼠的改良Garcia评分在SAH术后1，3，7，14，28天进行，主要从运动、感觉和前庭 功能等方面对大鼠的神经功能进行评估。每组大鼠行为学评分显示如图5,各个时间点假手 术组大鼠之间行为学均无明显差异(Ρ>〇.〇5)ΑΑΗ术后1天miR-103-3p反义寡聚核苷酸组大 鼠的运动、感觉及前庭功能评分较反义寡聚核苷酸阴性对照组有明显改善(P〈〇.05)，随后 评分略有上升，但是3,7，14天miR-103-3p反义寡聚核苷酸组与反义寡聚核苷酸阴性对照组 相比差异仍具有统计学意义(P〈〇. 05)。
[0060]上述结果证实:miR-103-3p反义寡聚核苷酸能够改善蛛网膜下腔出血后的早期脑 损伤，包括降低神经元的死亡和凋亡，改善血脑屏障的破坏，进而对脑组织起到保护作用， 可用于制备治疗蛛网膜下腔出血的药物。
【主权项】
1. 一种针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO.l 所示。2. 根据权利要求1所述的针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸，其特征在于:所述的针对 miR-103_3p的反义寡聚核苷酸经过5 '端胆固醇修饰和3 '端甲基化修饰。3. 权利要求1或2所述的针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸在制备治疗脑血管病的药 物中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的脑血管病为蛛网膜下腔出血、蛛网膜 下腔出血后的早期脑损伤。5. -种用于治疗脑血管病的药物，其特征在于包括药理学有效剂量的权利要求1或2所 述的针对miR-103-3p的反义寡聚核苷酸以及药理学可接受的载体。6. 根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述的脑血管病为蛛网膜下腔出血、蛛网膜 下腔出血后的早期脑损伤。
【文档编号】A61P9/10GK106086026SQ201610489433
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】叶瑞东, 王刘敏, 刘新峰
【申请人】叶瑞东