siRNA、互补寡聚DNA、PGC-1抑制剂、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及W植物siRNA发生器为基础的PGC-1抑制剂、 其制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 过氧化物酶体增殖物激活受体Y协同激活子1 (PGC-1、PGC-1 α或PPARGC1) 在1998年作为PPARY的转录辅助激活因子首次在小鼠体内发现，随后，人类和大鼠的 PGC-1 α基因也分别于1999年和2000年成功被克隆。PGC-1包括PGC-1 α、PGC-1目、PGC-1 相关辅助激活子（PCR)等3个家族成员，在哺乳动物间均具有相对保守的结构特点。
[0003] PGC-1主要分布于必、肝、肾、骨骼肌及踪色脂肪等组织；必脏中表达最高，其次是 肌肉和肝脏，在肾脏、踪色脂肪等有高能量需求或适应性产热作用的组织中表达水平也相 当高。PGC-1与多种核激素受体及其他转录因子相互作用，调节其下游核受体控制的祀基因 的转录起始、RNA加工等环节，从而多方面介导目的基因的转录激活，进而广泛参与糖代谢、 脂代谢、能量代谢，并参与多种代谢通路的调节活动，如机体适应性产热、线粒体生物合成、 脂肪酸目氧化、肌肉中葡萄糖转运、骨骼肌纤维类型转换、肝糖异生代谢等生理活动。
[0004] 人类PGC-1氨基酸序列与猩猩同源性为99%，与大鼠、小鼠、兔、马同源性为95%， 由798个氨基酸组成，分子量为91ku。PGC-1基因定位于人染色体4pl5. 1，全长67化，包含 13个外显子和12个内含子，其开放读码框的pen reading化ame，0RF)含2394个核巧酸， 其中，第6号外显子最小，包含46个核巧酸，8号外显子最大，包含916个核巧酸。由于尾部 多聚腺巧酸信号的不同，PGC-1存在两种mRNA转录本，长度分别为6. 4化和5. 3化。
[000引 PGC-1包括PGC-1 α、PGC-1目、PGC-1相关辅助激活子（PRC)等3个家族成员， 通常所说的PGC-1是指PGC-lct。PGC-1在斑马鱼、爪耀、哺乳动物间均具有相对保守 的结构特点；其蛋白多肤的N末端为含有LXX化基序的转录激活域，及一个双向核定位 信号度ipartite nuclear localization si即al), LXXIX基序化为亮氨酸，X为其它 氨基酸）可与某些核受体的特定区域结合，调控基因表达；C末端则为RNA加工域，包 括一个RNA识别基序（RNA-binding motif, RMM)和富含丝氨酸/精氨般的SR结构域 (Serine-arginine-rich domain),可与有关祀基因启动子结合，参与新转录的mRNA的加 工处理过程，二者同时存在于一个分子中，是PGC-1的结构特征，在转录激活域和RNA加工 域之间存在一个抑制域，含有3个保守的蛋白激酶A(Protein kinase Α,ΡΚΑ)作用的磯 酸化位点，当体内cAMP浓度升高时，它们能被Ρ38ΜΡΚ磯酸化，从而增强PGC-1介导的转 录激活作用；此外，PGC-1分子中还存在与PPARY、核呼吸因子（NRF1、2)、线粒体转录因子 (mtTFA)、雌激素受体（邸α )及肌细胞增强子（MEF2C)等结合的位点。PGC-1未与转录因子 结合前活性很低，结合后，活性可大大提高。
[0006] 影响PGC-1表达的因素有很多，如环境、饮食、锻炼及膜岛素、瘦素等物质。在前 述组织中，PGC-1受不同信号诱导而表达上调，如寒冷刺激能诱导踪色脂肪组织和骨骼肌中 PGC-1表达增加，禁食可诱导肝脏PGC-1表达上调，而骨骼肌还可能因耐力锻炼使PGC-1表 达增加。PGC-1表达涉及转录及翻译后调节。PGC-1启动子及上游区域序列中含有膜岛素应 答序列（IRSs)、cAMP应答元件（CR巧及Μ邸2c结合一致序列等结构域，在不同生理条件下， 分别与叉头转录因子（ForWiead homologuein rh油domyosarcoma, FKHR)cAMP应答兀件结 合蛋白（CREB)、肌细胞增强因子2(MEF2c)等转录因子结合后，通过不同机制调控PGC-Ια 表达，其中转录水平的调控主要有肌细胞增强子2c/组蛋白去己醜酶（MEF2c/HDACs)调节 通路、P13K-P邸-FKHR调节通路和CREB/CRE调节通路。
[0007] PGC-1作为核辅激活因子，基于其核巧酸和氨基酸序列的特点，通过多种机制发 挥作用。根据不同的作用方式，PGC-1与多种核激素受体及其他转录因子相互作用，调节 其下游核受体控制的祀基因的转录起始、RNA加工等环节，从多方面介导目的基因的转录 激活，从而广泛参与糖代谢、脂代谢、能量代谢W及骨骼肌纤维类型决定等多种代谢通路的 调节活动，如机体适应性产热、线粒体生物合成、脂肪酸β氧化、肌肉中葡萄糖转运、骨骼 肌纤维类型转换、肝糖异生代谢等生理活动；送些作用主要是通过协同激活多种转录因子 女口 PPARY、NRF1、MEF2C、（GLUT-4)完成。如PGC-1协同PPARY转录因子调控线粒体脂肪 酸氧化过程中关键酶的表达，从而调节脂肪酸的目氧化；糖皮质激素受体及肝细胞核因子 (ΗΝΤ4 α )在被PGC-1辅助激活后，可激活糖异生关键酶组如PEPCK等，促进肝糖异生导致 肝糖输出；PGC-1结合并协同刺激MEF2C可使化UT4表达明显增加，促使葡萄糖转运能力提 局。
[0008] 在肥胖或者糖尿病等病理状态下，肝脏PGC-1 α表达异常增高，激活糖异生关键 酶，使肝糖输出增加，空腹血糖升高，在肝脏膜岛素抵抗（IR)的形成中发挥重要作用，因 此，在送些病理状态下，目的性地下调患者的PGC-1表达水平变的十分有必要。
[0009] 小干扰核糖核酸（siRNA)是一类由20多个核巧酸组成的双链RNA分子，可W通过 特异性降解祀基因的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表达的作用，送一 过程被称为RNA干扰（RNA interference, RNAi)，在基因调控和生长发育等方面发挥着重 要作用。
[0010] RNA干扰（RNAi)是一种抗病毒机制。它是由dsRNA介导的序列特异性的同源基因 的转录后的基因沉默，在细胞内有效作用方式为siRNA。RNA干扰可W利用siRNA或siRNA 表达载体特异地沉默祀基因，此方式快速、经济、简便，且具有高度的序列专一性，可W获得 功能丧失或减低突变序列特异方式剔除目的基因表达，成为探索基因功能的重要研究手 段。大量实验证明，RNAi现象广泛存在于生物界中，是生物抵御病毒侵染和阻断转座子的 古老防御机制之一。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能 基因组和基因治疗研究中的有效工具，RNAi也越来越为人们所重视。
[0011] 然而，目前市面上特异性针对PGC-1治疗的抑制剂还很少见，并且许多抑制剂的 抑制效果及副作用尚不明确。利用RNAi技术可W针对PGC-1的特定基因序列设计产生特 定的siRNA，用于特异性的抑制PGC-1基因的表达，从而降低PGC-1的表达水平，缓解PGC-1 过表达引起的症状。但是一般情况下生产siRNA都处于试验阶段，规模很小，难W用于大规 模的提取和使用。
【发明内容】
[0012] 为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。除非另外说明，本文所出现的术语具 有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。具体地：
[0013] 除非另外指出，本文中所述的"PGC-1"是指过氧化物酶体增殖物激活受体Y协同 激活子1，也称PGC-1 α或PPARGC1。
[0014] 除非另外指出，本文中所述的"Α549细胞"是指人肺癌上皮细胞。
[001引除非另外指出，本文中所述的"Α549基因组DNA"是指人肺癌上皮细胞的基因组 DNA，实验中未使用癌细胞所有基因组的序列进行设计，Α549是人肺腺癌细胞，实验中设计 的siRNA针对的是癌细胞中PGC-1基因序列，因此只涉及到PGC-1基因序列，PGC-1基因序 列 ACCESSION:AF106698。
[001引除非另外指出，本文中所述的"Oligo DM"即短链DNA，寡核巧酸， oligoribonucleotide。
[0017] 针对前述现有技术中存在的问题，本发明人棍奇地发现，利用基因工程植物生产 PGC-1基因的SiRNA抑制剂，其成本低，来源为天然成分，无化学污染，通过植物生产PGC-1 基因的SiRNA抑制剂方法简便，有利于批量生产和采集。
[001引因此，本发明的的一个目的是提供一种用于抑制PGC-1基因的SiRNA。本发明的 另一个目的是提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的互补寡聚DNA。本发明的另一个目的 是提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的重组表达载体质粒。本发明的另一个目的是提供 用于制备PGC-1基因抑制剂的农杆菌。本发明的另一个目的是提供一种用于制备PGC-1抑 制基因重组真核表达载体质粒的方法。本发明的另一个目的是提供一种用于制备PGC-1基 因抑制剂的脂质体。本发明的另一个目的是提供一种通过植物制备PGC-1基因抑制剂的方 法。本发明的另一个目的是提供一种PGC-1抑制剂。本发明的还一个目的是提供如前所述 的siRNA和/或如前所述的互补寡聚DNA的用途。
[0019] 本发明的上述发明目的是通过W下技术方案实现的：
[0020] -方面，本发明提供一种用于抑制PGC-1基因的SiRNA,所述SiRNA具有如下所示 的核巧酸序列：
[0021] 正义链；5'-。邑日州雌邑日11日。日邑日。日邑。44-3';
[0022] 反义链；5' -AAgcugaaccuaugucugucg-3'。
[0023] 另一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的互补寡聚DNA，所述互补 寡聚DNA具有如下（I)或（II)任意之一所示的核巧酸序列：
[0030] 另一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的互补寡聚DNA，所述互补 寡聚DNA具有如下（III)或（IV)任意之一所示的核巧酸序列：
[0031] 反义祀序列 正义祀序列
[0032] 5' -AGCTgctgaacctatgtctgtc^CAAGAGcgacttggatacagacagcAA-3'〇
[0033] (III)
[0034] 反义祀序列 正义祀序列
[0035] 5' -AGCTgctgaacctatgtctgtcgCTCTTGAcgacttggatacagacagcAA-3'。
[0036] (IV)
[0037] 再一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的重组表达载体质粒，所 述重组表达载体质粒可W产生如前所述的siRNA，优选地，所述质粒为PBI121。
[0038] 又一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的农杆菌，所述农杆菌使 用如前所述的重组表达载体质粒直接转化，优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌。
[0039] 再一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1抑制基因重组真核表达载体质粒的方 法，所述方法包括如下步骤；
[0040] (1)通过（ΙΠ )或（IV)所述的互补寡聚DNA经两两混合、退火，形成双链DNA ;
[0041] (2)将步骤（1)退火得到的双链DNA稀释后，连接至真核表达质粒载体即制得所述 PGC-1抑制基因重组真核表达载体质粒；优选地，所述重组真核表达载体质粒是通过T4连 接酶与经过化ndlll酶切的PCDNA3. 1质粒室温连接得到的重组PCDNA3. 1质粒。
[0042] 又一方面，本发明提供一种用于制备PGC-1基因抑制剂的脂质体，所述脂质体使 用如前所述的PGC-1抑制基因重组真核表达载体质粒制备。
[0043] 还一方面，本发明提供一种通过植物制备PGC-1基因抑制剂的方法，所述方法包 括如下步骤：
[0044] (1)针对P