专利名称：一种抑制聚合酶链式反应试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚合酶链式反应试剂盒，更具体地说，本发明涉及一种操作简单、 且能够提高PCR扩增特异性的、高特异性的DNA体外扩增技术，即抑制聚合酶链式反应检测试剂盒，属于分子生物学检测技术中的DNA体外扩增技术领域。
背景技术：
在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链式反应是最主要的也是很有效的常用技术。在常规PCR中，经常遇到引物二聚体和其它非特异性扩增的产生，最易产生引物二聚体和其它非特异性扩增的时段为反应液混合后至温度升高到设定温度前，其次为扩增的最初数个循环，因为此时引物浓度最高，最易引发非特异扩增，而一旦产生非特异性模板包括引物二聚体，由于其与特异性扩增的效率相当，并竟争底物与酶，往往与特异性扩增差不多同时进入扩增的平台期，这不仅使扩增结果难以判断，而且使特异性扩增效率降低，尤其在扩增粗提的临床标本时，常导致临床基因诊断的假阳性和假阴性结果的产生。用于提高PCR扩增特异性的方法已有热启动法、固体石蜡膜法、抗体-酶法等，但这些方法只能部分地达到降低非特异性扩增的目的，而一旦非特异性模板产生，它们均不能有效抑制非特异扩增的继续进行。
发明内容
本发明的目的在于建立一种操作简单，且能提高PCR扩展特异性的、高特异性的DNA体外扩增技术，即抑制聚合酶链式反应检测试剂盒，其英文名称是suppression polymerase chain reaction， 英文缩写是S-PCR。本发明的技术方案是首先根据待扩增靶DNA序列合成一对特殊的抑制引物，该引物的3’端约15 18个碱基与模板DNA序列互补，其5’端11 14个碱基则与其自身序列形成反向互补；然后溶解引物使引物形成部分双链结构；最后将抑制引物加入含有耐热 DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；在温度较低时(即常规PCR条件下最易产生非特异扩增和引物二聚体)，由于抑制引物主要以双链形式存在，处于失活状态，故大大降低了非特异扩增和引物二聚体产生的可能性；以使模板DNA变性、引物与模板复性、 引物沿模板DNA延伸反复进行，而达到靶DNA片段在体外呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)，在扩增的过程中，当温度降低到退火温度时，除了与模板特异结合外，还会有大量的抑制引物自身复性成双链引物，从而快速降低有效引物的浓度，抑制非特异扩增的产生；而一旦产生了非特异性扩增的模板，则在后续的热循环中，由于链内复性的优先性，则会使大部分非特异性扩增的单链两端复性产生发夹结构，失去成为有效PCR模板的活性，因而提高了扩增的特异性。所用扩增缓冲反应体系是由抑制引物、耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、Mg++、PCR缓冲液、超纯水等组成的，各个成分的终浓度分别如下特异的引物每条0. 2-0. 4umol/ L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5讓01/1、模板0嫩若干、]\%++1. 5-3. 5mmol/ L、缓冲液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KC1、lOmmol/LTris. HC1PH8. 3、 0.01%明胶。该S-PCR由于不仅能够抑制非特异性扩增的产生而且能够抑制非特异性扩增进行，与常规PCR方法和其它常见的提高PCR特异性的方法相比，具有很大的优越性。根据上述S-PCR原理，将上述引物和其他PCR试剂混合后分装到PCR扩增管中，并配以系列稀释度的标准DNA模板组装成S-PCR试剂盒。有鉴于此，我们设计了一种操作简单、不仅能够抑制非特异性扩增的产生而且能够抑制非特异性扩增进行的DNA体外扩增技术即抑制聚合酶链式反应试剂盒。
具体实施例方式实施例1.材料用本室常规的盐析法提取30份正常人外周血DNA，作为待扩增模板。引物设计根据脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1， FMRl)的 5，非翻译区序列(GenBanK S74494 和 Nature Genet，8 (1) 88-94，1994)合成以下特异的内外侧引物，其中非阴影部分为FMRl特异序列，与模板互补，阴影部分为与其自身序列形成反向互补的序列上游抑制引物Pl :5，-CCA CCG GAA GGT GAT CAC CTT CCG GTG GAG-3，(SEQ ID NO 1)；下游抑制引物P2 :5，-GGC TGA AGA GAA GCT TCT CTT CAG CCC TG-3，(SEQ ID NO 2)；2.抑制聚合酶链式反应检测试剂盒的反应S-PCR 混合50ul反应体系，内含内、外侧引物(PI、P2)各IOpmol，正常人DNA 5-10ng, IX PCR 缓冲液，Taq DNA 聚合酶 2u，Mg++ 终浓度 2mmol/L，然后在 PE9600 上 96°C下变性5分钟，然后按96°C 20秒，65°C 40秒，72°C 1分30秒热循环35次。3. 2. 5%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，GelDoclOOO下观察，灰度扫描分析记录各聚合酶链式反应的结果。4.结果在30个标本的S-PCR反应和对应的常规PCR中都获得了预期大小的PCR产物条带，未加DNA标本的阴性对照未见相应扩增产物，并且未发现非特异扩增的产物带。本发明属于分子生物学检测技术中的DNA体外扩增技术领域。
权利要求
1.一种操作简单、特异性高的DNA体外扩增技术即抑制聚合酶链式反应检测试剂盒， 其英文名称是suppression polymerase chain reaction英文缩写是S-PCR ；首先根据待扩增靶DNA序列合成一对特殊的抑制引物，该引物的3’端约15 18个碱基与模板DNA序列互补，其5’端11 14个碱基则与其自身序列形成反向互补；然后溶解引物使引物形成部分双链结构；最后将抑制引物加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环。
2.根据权利要求1所述的一种抑制聚合酶链式反应检测试剂盒，其特征在于所用引物为一对特殊的抑制引物，该引物的3’端约15 18个碱基与模板DNA序列互补，其5’端 11 14个碱基则与其自身序列形成反向互补。
3.根据权利要求1所述的一种抑制聚合酶链式反应检测试剂盒，其特征在于所述扩增缓冲反应体系中各成分及其浓度含量分别如下抑制引物各0. 2-0. 4umol/L、Taq DNA聚合酶 l-3U/50ul、dNTPs 底物 0. 2-0. 5mmol/L、模板 DNA 若干、Mg++1. 5-3. 5mmol/L、缓冲液 1-1.5XPCR;其中 IXPCR 缓冲液包括 50mmol/L KCU10mmol/L Tris. HC1PH8. 3、0. 01 % 明胶。
4.根据权利要求1所述的一种抑制聚合酶链式反应检测试剂盒，根据该技术要求所组装的抑制聚合酶链式反应检测试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种操作简单、特异性高的DNA体外扩增技术即抑制聚合酶链反应检测试剂盒，其英文名称是suppression polymerase chain reaction，英文缩写是S-PCR，首先根据待扩增靶DNA序列合成一对特殊的抑制引物，该引物的3’端约15～18个碱基与模板DNA序列互补，其5’端11～14个碱基则与其自身序列形成反向互补；然后溶解引物使引物形成部分双链结构；最后将抑制引物加入含有耐热DNA聚合酶、dNTPs、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等组成的PCR扩增缓冲反应体系中，在热循环仪上进行高温、低温、中温的反复热循环；在扩增的过程中，当温度降低到退火温度时，除了与模板特异结合外，还会有大量的抑制引物自身复性成双链引物，由于链内复性的优先性，则会使大部分非特异性扩增的单链两端复性产生发夹结构，失去成为有效PCR模板的活性，因而提高了扩增的特异性。
文档编号C12Q1/68GK102251027SQ20111015026
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月7日 优先权日2011年6月7日
发明者刘钦松, 夏庆杰 申请人:刘钦松