制备在利用核酸聚合酶来检测核酸时使用的高精度核酸的方法

制备在利用核酸聚合酶来检测核酸时使用的高精度核酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备具有高灵敏度的核酸的方法，其中在用于检测痕量核酸的聚合反应(如PCR反应、实时定量PCR或类似反应)之前使用核酸聚合酶向待用于分析的核酸中加入终止子，使得可以基本上消除与靶核酸的扩增反应争性地出现的非特异性引发，从而精确地仅检测痕量的靶核酸并精确地测量靶核酸的浓度。
【专利说明】制备在利用核酸聚合酶来检测核酸时使用的高精度核酸的 方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备在通过核酸聚合酶来检测核酸时使用的、具高灵敏度的核酸 的方法，更具体而言，本发明涉及一种制备核酸的方法，所述核酸通过防止非特异性核酸聚 合而能够检测痕量核酸，所述非特异性核酸聚合是由于包含在提取自生物样品的核酸中的 单链核酸引起自引发（self-priming)所诱发，制备在核酸检测中用于检测核酸的核酸样 品的方法在室温下使用PCR、RT-PCR、定量PCR、定量RT-PCR、转录扩增或核酸扩增所需的核 酸聚合酶和引物。

【背景技术】
[0002] 各种利用核酸聚合酶来检测核酸的方法以高灵敏度和特异性已被用于各种检查， 例如针对病毒、病原体、致癌基因等的测试。高灵敏度可以通过利用检测用的核酸聚合酶将 靶核酸的数量扩增到上亿或更多来实现。高特异性可通过利用与靶核酸特异性杂交的引 物，以在杂交温度下经由与靶核酸选择性地杂交，通过引发（priming)而选择性地进行核 酸聚合反应来实现。然而，在诸如PCR反应、实时定量PCR反应等的具有多种核酸聚合酶的 检测方法中，对于检测痕量的核酸而言，非特异性引发和随后的聚合反应扮演着劣化检测 极限的主要因素。由于添加的引物与用于引发反应的靶核酸杂交，并且以众多数量竞争性 存在的单链核酸非特异性地且部分地杂交而引发，使得核酸聚合反应竞争性地出现，故造 成非特异性扩增。
[0003] 与针对DNA的检测相比，针对大多数包括单链核酸的RNA的检测通常以较小灵敏 度进行。一般而言，用于检测RNA的方法通过逆转录（RT)反应接着PCR反应来进行。对于 具有高灵敏度的反应而言，RT反应首先在一个反应器中进行，在RT反应完成后，在单独的 反应器中利用RT反应产物进行PCR反应。
[0004] 然而，在这种情况下，由于反应管需要再次打开以添加溶液，这不方便的且当打开 反应管并进行操作时有被污染的高度可能性，故而主要使用通常在一个管中包括逆转录酶 接着PCR反应的逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR)方法。然而，在这种情况下，与分别进 行反应的情况相比，存在灵敏度大大劣化的问题。
[0005] 逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR)在进行逆转录反应时需要引物，其中有使用 随机引物的方法和使用作为靶特异性引物的反义引物的方法。
[0006] 使用随机引物的方法能够制备关于全部核酸的CDNA，因而已被主要用于制备 cDNA库或用于分析转录组的cDNA。然而，在检测痕量RNA的情况下，由于合成了关于全部 RNA的cDNA而制备了许多非靶cDNA，故非靶DNA的量过度增加，使得难以如上所述地检测 到靶。需要如上所述的高灵敏度的检测（如RNA病毒诊断试剂盒）通常采用一种利用与靶 RNA互补的反义引物的方法。
[0007] 靶特异性反义引物通常能够提高检测极限。然而，即使使用靶特异性引物，由于在 含有室温下对RNA具有高活性的逆转录酶的混合反应溶液中，在低于引物杂交温度的温度 下发生非特异性引发以及随后的逆转录酶反应是不可避免的，故出现了制备出许多非特异 性cDNA的问题。
[0008] -种被开发来克服上述问题并检测痕量的核酸的技术是热启动PCR反应。热启动 PCR反应是一种包括在低温下的样品混合过程以控制不起始PCR反应，然后仅在靶特异性 引物的杂交温度以上活化PCR反应的方法。
[0009] 在该方法中，PCR反应仅在达到引物与靶核酸实现完全杂交的温度后才起始，从而 防止了在低于引物杂交温度的温度下具非特异性引发的PCR反应进程。作为一种特异性方 法，开发了热启动PCR方法，其中反应溶液中包含作为聚合酶抑制剂的焦磷酸酯，且反应中 额外包含降解焦磷酸酯的焦磷酸酶以通过在引物的杂交温度下反应预定时间来消除焦磷 酸酯，这样接着起始PCR反应，从而可抑制在低温下的非特异性核酸合成，以检测痕量的核 酸。热启动PCR方法描述于本申请的 申请人:所提交的韩国专利第10-1098764号中。
[0010] 然而，在包含痕量靶RNA的情况下，即使通过反义引物或热启动逆转录酶反应来 进行反应，也不能够实际进行只有相关靶RNA的cDNA的合成。原因是当反义引物杂交时， 各种RNA而非引物能够在低温下杂交。各种非靶RNA可起到用于逆转录酶反应的引物的作 用，并最终可与靶核酸杂交且起到引物作用从而制备各种cDNA。
[0011] 特别而言，在进行使用含有大量RNA的样品的逆转录酶反应的情况下，其中所述 RNA各具有IOObp或更少的短长度，例如提取自血清或石蜡块组织的RNA作为模板，包含了 许多长度比引物长度稍长的RNA，使得各种RNA在逆转录酶反应温度下引发，从而制备数量 极其多的cDNA。cDNA参与PCR反应，生成各种非特异性扩增产物。当进行靶向包含痕量癌 细胞或RNA病毒的生物样品的检查时，这种现象是严重的问题。为检测靶RNA，需要以尽可 能大的量从生物样品中提取出核酸，其中所提取的RNA量随生物样品的量成正比地增加， 非靶RNA的量不可避免地增加，并最终通过非特异性逆转录酶反应制备无数cDNA。此外，在 cDNA当中，包括具有与靶特异性引物部分类似的碱基序列的cDNA，从而在随后的PCR反应 步骤中非特异性地扩增，使得在靶核酸扩增之前，非靶核酸就扩增而结束反应，最终，这成 为阻碍扩增和检测痕量癌细胞或病毒的RNA的主要原因。
[0012] 为了解决上述问题，正进行着各种尝试。
[0013] 首先，尝试通过更特异性地杂交引物来提高特异性靶标的检测极限。开发了 一种用LNA取代引物的5'末端以更牢固地与靶标杂交，由此减少非特异性扩增的方法 (Malgoyre A et al. , Biochem Biophys Res Commun. , 354:246, 2007)〇
[0014] 第二，当在RT反应步骤中进行RT反应时，特别是在低温下，通过引物之间的部分 杂交而开展聚合，使得可形成二聚体，这是RT反应的灵敏度迅速劣化的主要原因之一。为 解决该问题，开发了使引物尽可能多地在低温下不部分杂交的技术。开发了经延伸使得5' 碱基序列的5bp碱基形成发夹的引物（Hong, J.Y.et al.，Virol J. 8:330,2011)。
[0015] 然而，由于Rock引物方法通过额外添加碱基序列而具有高的杂交温度，故可能诱 发对具有类似碱基序列的非特异性靶标的非特异性杂交，且在杂交步骤中发夹结构可能稍 微劣化效率。
[0016] 此外，曾宣称当通过使用在高温下杂交的引物和即使在高温下也工作的AMV逆转 录酶来在诸如TO 11C的高温下合成cDNA时，引物可能更特异性地扩增（Fuchs B et al.，Mol Biotechnol.，12:237, 1999)。在多重RT-PCR反应中，特异性更加重要。
[0017] 多重单管RT-PCR方法是一种使用受热分解的磷酸三酯的方法，其中引 物初始被封闭，然后按顺序地受热水解并用作引物（Hidalgo AE et al.，BMC Mol Biol.，10:113, 2009)。通过使用该方法，可防止经由正义引物的非特异性引发以抑制cDNA 非特异性合成，从而提高多重RT-PCR特异性和灵敏度。
[0018] 此外，为提高用于检查呼吸检查样品中的各种病毒的试剂盒的灵敏度，开发了一 种方法，其中排除了同源于rRNA的引物，使得包含在呼吸样品中的rRNA不进行逆转录反 应，且在进行RT反应时一同添加寡核苷酸（oligo)，所述寡核苷酸中与具有互补于rRNA的 碱基序列的部分相对应的3'端被封闭，从而防止rRNA的逆转录和扩增，使得可高灵敏度地 进行 RT-PCR(de Vries M et al·，PLoS ONE, 6: el6118, 2011)。
[0019] 进一步地，Taqman方法中使用实时定量PCR的在管（on-tube) RT-PCR方法提供 了高灵敏度和高选择性，然而，具有这样的问题，即在含有RNA/DNA的样品中，例如提取自 血液的含有核酸的样品中，可能不能对每个反应都检测到100拷贝或更少的样品（Espy M. J. et al, Clin. Microbiol. Rev. 19:165, 2006)。为解决该问题，已经使用了一种最初通过 普通PCR的15循环进行扩增、然后在此上进行实时定量PCR的方法，然而，其不方便且有假 阳性的风险（Brian H. Bird et al, J Clin Microbiol. 45:35063513, 2007)。
[0020] 类似于上述情况，在含有小碎片的DNA片段的DNA核酸提取物的情况下，所述小 碎片是由于生物样品的分离?纯化过程和样品的分解引起，在PCR反应中该核酸提取物在 95°C下被修饰，然后大量的非特异性核酸通过非特异性引发而扩增，所述非特异性引发中 许多小碎片的单链DNA起到杂交过程中的引物的作用，使得可能检测不到预期的靶核酸。
[0021] 为进行核酸的精确检查，高效率地提取核酸以进行高灵敏度的核酸扩增很重要。 即使已开发了多种类型的用于自动进行核酸提取的提取核酸自动化设备，由于模板核酸自 身被非特异性地引发而在用以检测痕量核酸的、使用核酸聚合酶和引物以用于扩增核酸的 反应（如PCR反应或实时定量PCR反应）中被主要地扩增，故可能出现假阳性，或者难以检 测靶核酸。
[0022] 因此，本发明的
【发明者】们发现了一种制备能够高灵敏度地仅扩增和检测靶核酸 的、高灵敏度的核酸的方法，所述方法使用通过如下方式制备的模板核酸：先向模板核酸中 加入终止聚合反应的核酸聚合终止子和聚合酶以进行聚合终止反应，然后消除所述核酸聚 合终止子，从而完成了本发明。
[0023] 更具体而言，由所述制备高灵敏度的核酸的方法发现，将核酸聚合终止子添加到 模板核酸中，所述模板核酸在用于检测痕量核酸的、使用核酸聚合（如PCR反应或实时定量 PCR反应）来检测核酸时使用，使得可以基本上消除抑制靶核酸的扩增反应的非特异性自 引发和随后的非特异性扩增。


【发明内容】

[0024] 本发明的一个目的在于提供一种核酸聚合终止子，所述核酸聚合终止子通过终止 模板核酸的3'末端而能够制备以高灵敏进行核酸扩增反应所需的核酸。
[0025] 本发明的另一个目的在于提供一种使用核酸聚合终止子来制备具有高灵敏度的 核酸的方法。
[0026] 本发明的另一个目的在于提供一种扩增核酸的方法，包括用于制备核酸的方法。
[0027] 本发明的另一个目的在于提供一种用于制备核酸的试剂盒，包括核酸聚合终止 子。
[0028] 本发明的另一个目的在于提供一种用于纯化核酸的自动化设备，包括储存核酸聚 合终止子的储存部分；和向含有靶核酸的样品供给核酸聚合终止子的供给部分。
[0029] 本发明的另一个目的在于提供一种用于检查核酸的全自动装备，包括用于纯化核 酸的自动化设备。
[0030] 本发明的另一个目的在于提供一种用于聚合核酸的组合物，包含被核酸聚合终止 子结合于3'以防止非特异性反应的模板核酸。
[0031] 为实现上述目的，本发明提供了一种制备核酸的方法，包括：1)使包含核酸、核酸 聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终止子的反应混合物反应，其中所述核酸聚合终止子抑 制核酸的3'末端延伸以终止核酸的3'末端；和2)从反应混合物中灭活或消除未反应的 游离核酸聚合终止子，作为在使用核酸聚合反应来扩增和检测核酸时使用的核酸的制备方 法。
[0032] 此外，本发明提供了一种用于制备核酸的试剂盒，包括核酸聚合酶、酶反应缓冲液 和核酸聚合终止子，其中所述核酸聚合终止子抑制核酸的3'末端的延伸，所述核酸是在使 用核酸聚合反应来扩增和检测核酸时使用的核酸的制备方法所需的。
[0033] 进一步，本发明提供了一种用于纯化核酸的自动化设备，包括储存核酸聚合酶和 核酸聚合终止子的储存部分；和向含有靶核酸的样品供给核酸聚合酶和核酸聚合终止子的 供给部分。
[0034] 本发明提供了一种用于检查核酸的全自动装备，包括用于纯化核酸的自动化设 备。
[0035] 此外，本发明提供了一种使用用于核酸聚合反应的模板核酸的核酸聚合方法，其 中核酸聚合终止子结合于3'末端以防止非特异性核酸聚合。
[0036] 进一步，本发明提供了一种用于核酸聚合的组合物，包含被核酸聚合终止子结合 于3'末端以防止非特异性核酸聚合的模板核酸、Mg 2+离子、4种dNTP、DNA聚合酶和用于扩 增模板核酸的引物。
[0037] 此外，用于核酸聚合的组合物可进一步包含阻断寡核苷酸，所述阻断寡核苷酸具 有与用于扩增模板核酸的引物互补的碱基序列和经阻断的3'羟基。

【专利附图】

【附图说明】
[0038] 图1是本发明比较例1的结果，其示出经由短RNA片段的逆转录酶聚合酶链式反 应产物的电泳照片（A :RNA寡核苷酸，B :DNA寡核苷酸）。
[0039] 图2是本发明比较例1的结果，其示出经由短RNA片段的非特异性逆转录酶聚合 酶链式反应和PCR反应产物的电泳照片。
[0040] 图3是本发明实施例1的结果，其示出使用Maldi-tof质谱仪经由3'-脱氧腺苷 5'-三磷酸（3' -dATP)的反应的终止。
[0041] 图4是本发明实施例1的结果，其示出经由3'-脱氧腺苷5'-三磷酸 (3' -dATP)终止的单链RNA的非特异性逆转录酶聚合酶链式反应产物的电泳照片（A: 不具有合成的3'-脱氧腺苷5'-三磷酸（3' -dATP)的RNA寡核苷酸，B :具有合成的 3'-脱氧腺苷5'-三磷酸（3' -dATP)的RNA寡核苷酸）。
[0042] 图5是本发明比较例3的结果，其示出通过提取自人血清的RNA的实时逆转录酶 聚合酶链式反应抑制现象的证实（A :提取自DEPC-D. W的样品，B :提取自人血清的样品）。
[0043] 图6是本发明实施例2的结果，其示出通过终止人血清中存在的RNA的实时聚合 酶链式反应抑制现象的证实（A :模板RNA，B :将通常提取自人血清的RNA加入模板RNA中， C :将通常提取自人血清的RNA经终止然后加入模板RNA中）。
[0044] 图7是本发明实施例2的结果，其示出使用碱性磷酸酶（CIP)的3'-脱氧腺苷 5 '-三磷酸（3 ' -dATP)的活化抑制的证实（A :通过终止RNA并使用CIP水解3 '-脱 氧腺苷5'-三磷酸（3' -dATP)所获得的样品，B :在通过3'-脱氧腺苷5'-三磷酸 C -dATP)终止RNA后含有Y -脱氧腺苷Y -三磷酸（3' -dATP)而未纯化的样品， C :通过AccuPr印PCR纯化消除了 3'-脱氧腺苷5'-三磷酸（3' -dATP)的样品）。
[0045] 图8是本发明实施例3的结果，其示出通过RNA终止的经由RNA自引发的非特异 性逆转录酶聚合酶链式反应抑制效果的证实，所述非特异性逆转录酶聚合酶链式反应采用 通用逆转录酶聚合酶链式反应（A和C)和热启动逆转录酶聚合酶链式反应（B和D) (A :未 终止的RNA，B :未终止的RNA，C :经终止的RNA，D :经终止的RNA)。
[0046] 图9示出根据本发明的缓冲盒（cartridge)。
[0047] 图10示出使用图9的缓冲盒的核酸制备方法的试验流程图。
[0048] 图11是示出通过阻断寡核苷酸的非特异性反应抑制效果的图表。
[0049] 图12示出基于在构建阻断寡核苷酸时使用的各种修饰，非特异性反应抑制效 果的证实，其中A是使用具有热启动功能的产物的阳性对照组，B-G示出通过胺、磷酸酯、 C3-间隔臂、C6-间隔臂、C12-间隔臂和C18-间隔臂修饰的情况，泳道1-3分别示出通过扩 增三种不同的靶碱基所获得的结果，泳道M示出能够区分DNA尺寸的IOObp的DNA分子梯 度。
[0050] 图13的A表示，在实时PCR中依赖于添加阻断寡核苷酸的引物二聚体和非特异性 反应的抑制效果，其中横轴表示PCR反应循环，纵轴表示基于反应循环测得的荧光值，线条 I示出对照组的荧光检测曲线的结果，线条II示出实验组的荧光检测曲线的结果；B是示出 使用荧光测量曲线的熔解曲线的图表，其中横轴表示温度变化，纵轴表示基于温度增加测 得的荧光值，线条I示出对照组的熔解曲线的结果，线条II示出实验组的熔解曲线的结果。

【具体实施方式】
[0051] 下面，将详细描述本发明。
[0052] 为对核酸进行精确的检查，不仅高效率地提取核酸很重要，而且在用于扩增核酸 的反应中高灵敏度地扩增和检测所提取的核酸也很重要。即使已开发了自动进行核酸提 取的、用于提取核酸的各种自动化设备，但当在使用核酸聚合酶和引物的、扩增核酸的反应 (如PCR反应或实时定量反应）中检测痕量核酸时，可能出现假阳性，或者难以检测靶核酸。
[0053] 因此，本发明的
【发明者】们发现，由于核酸自身被非特异性地自引发并在用于扩增 核酸的检查中（如用于检测靶核酸的PCR反应或实时定量PCR反应）被主要扩增，所以出现 了所述问题，因而向核酸中添加了终止聚合反应和核酸聚合酶的物质，接着终止使得核酸 不能够起到引物的作用，从而仅靶核酸可以高灵敏度被扩增并检测到，由此完成了本发明。
[0054] 在一个方面，本发明提供了一种使用核酸聚合反应来制备在扩增和检测核酸时使 用的核酸的方法，所述方法包括：
[0055] 1)使用含有核酸聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终止子的反应混合物，终止核 酸的3'末端；和
[0056] 2)从所述反应混合物中灭活或消除核酸聚合终止子。
[0057] 更具体而言，本发明提供了一种通过核酸聚合反应来制备用于扩增和检测核酸的 核酸的方法，所述方法包括：
[0058] 1)从含有核酸的生物样品中分离并纯化所述核酸；
[0059] 2)通过使用含有核酸聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终止子的反应混合物来终 止步骤1)所分离并纯化的核酸的3'末端；和
[0060] 3)从含有带被终止的3'末端的所述核酸的所述反应混合物中灭活或消除核酸聚 合终止子。
[0061] 根据本发明用于制备核酸的方法可应用于通常所知的自动化设备，用以提取 核酸，例如所述设备揭示于韩国专利第148239号，美国专利第5702590号，美国专利第 5647994号，欧洲专利第0691541号，美国专利第5336760号，美国专利第5897783号，美国 专利第6187270号和韩国专利申请第10-2009-025743号。此外，由Bioneer公司生产的 ExiPrepTM16-全自动DNA/RNA/蛋白质纯化系统可优选用作提取本发明的核酸的自动化设 备。
[0062] 本发明中，样品可以是来自含有作为多核苷酸的核酸的任何植物、动物、细菌或病 毒的样品。
[0063] 在本发明中，所述核酸是RNA或DNA，所述核酸聚合酶包括能够将终止子结合到 DNA或RNA的3'末端以使得聚合不再进一步进展的所有核酸聚合酶。
[0064] 更具体而言，优选本发明的核酸聚合酶不具有3' 一 5'外切酶活性，使得所述终止 子不再水解，更优选地，所述酶的效价可在超过90°C的高温下失去。所述核酸聚合酶可包括 选自由以下物质构成的组的至少一种：RNA依赖型RNA聚合酶、RNA依赖型DNA聚合酶、DNA 聚合酶和RNA聚合酶。
[0065] 所述RNA可以是mRNA、无多聚A尾巴的RNA或者病毒或原核生物RNA，但本发明并 不仅限于此。
[0066] 本发明中，所使用的RNA依赖型RNA聚合酶是一种通用的酶，其主要包含在病 毒中，以RNA作为模板合成RNA，可以使用来自诸如登革热病毒或口蹄疫病毒的黄病毒 (Flavivirus)的 NS5 酶。
[0067] 此外，本发明中使用的DNA聚合酶是指通过使用DNA链作为模板来合成新DNA链 的酶。DNA聚合酶包括Pol I型DNA聚合酶（例如大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow片段和 Taq DNA聚合酶）、非α、非Poll型DNA聚合酶（例如WO 97/24444中揭示的DNA聚合酶）， 但本发明并不限于此。
[0068] RNA依赖型DNA聚合酶是一种逆转录酶,可以使用各种逆转录酶,例如MMLV逆转录 酶、AMV逆转录酶、HIV逆转录酶等。此外，可以包括末端脱氧核苷酸转移酶（例如将腺苷结 合到3'末端的poly㈧聚合酶）作为RNA聚合酶。
[0069] 例如，作为HIV逆转录酶，在AZT (3'_叠氮_3'_脱氧胸苷）作为HIV治疗剂的人 体中，作为逆转录酶的活化形式的3' -叠氮-3' -脱氧胸苷5' -三磷酸可有效地用于本发 明中，所述3' -叠氮-3' -脱氧胸苷5' -三磷酸表现出的反应性是来自人的DNA聚合酶的 反应性的 100 倍高（Furman, P. A. et al.，PNAS, 83:8333, 1986)。
[0070] 本文使用的术语"核酸聚合终止子"是指终止所有核酸片段的聚合反应使得核酸 不再进一步延伸的物质，和结合于核酸片段末端使得核酸链延伸不再进一步发生的物质。
[0071] 本文使用的术语"终止"是指通过将"所述核酸聚合终止子"共价结合于核酸的3' 末端，核酸聚合反应不再进一步进展，其中将所使用的物质定义为终止子。
[0072] 更具体而言，本文中提及的术语"终止"是指通过将核酸的3'位置无羟基的物质， 或者具有经由聚合酶的聚合反应不进展的化学基团的物质，共价结合于核酸的3'末端，核 酸聚合反应不再进一步进展，其中所使用的物质定义为终止子。
[0073] 在本发明中，核酸聚合终止子是类核酸化合物，所述类核酸化合物作为能够作用 于核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，可以使用不存在3'羟基连接于核酸或者3'羟基被 其它基团所取代的各种核苷酸三磷酸酯，并且可选择使用与每种核酸聚合酶具有良好反应 性的核酸聚合终止子。
[0074] 在本发明中，所述类核酸化合物可以选自由以下物质构成的组中的至少一种： 2' 3' -双脱氧核苷5' -三磷酸、3' -脱氧腺苷5' -三磷酸、3' -叠氮-3' -脱氧胸苷5' -三 憐酸、1_ β _d_阿拉伯呋喃糖核苷酸（arabinofuranosylnucleoside) 5'-三憐酸、无环鸟 苷三磷酸、3' -氨基-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。 [0075] 更具体而言，作为来自大肠杆菌或耐热细菌的DNA聚合酶，可以使用Sanger开发 的大量用于双脱氧碱基序列测定的双脱氧核苷酸三磷酸酯（2' 3' -双脱氧核苷三磷酸： ddNTP)。
[0076] 本文使用的术语"双脱氧核苷三磷酸（ddNTP) "可包括选自由以下物质构成的组中 的至少一种：双脱氧鸟苷三磷酸（ddGTP)、双脱氧腺苷三磷酸（ddATP)、双脱氧胸苷三磷酸 (ddTTP)和双脱氧胞苷三磷酸（ddCTP)。
[0077] 脱氧核苷三磷酸（dNTP)可包括选自鸟苷、腺苷、胸苷、尿苷和胞苷中的至少一种。
[0078] 作为其实例，为进行使用DNA聚合酶的终止反应，可使用各种核酸聚合终止子。 在使用来自哺乳动物DNA聚合酶的情况下，可以使用与该酶具有高反应性的5'-三磷酸 1- β -d-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶或5'-三磷酸9- β -d-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤（J. J. Furth和 Seymour S. Cohen, Cancer Res, 28 ；2061,1968)〇
[0079] 此外，已大量用作抑制来自病毒的DNA聚合酶的抗病毒剂的阿昔洛韦 (acyclovir)核酸（无环核苷）的三磷酸也可用作核酸聚合终止子（P A Furman, et al.，J. Virol.,32:72, 1979)〇
[0080] 作为另一实例，作为RNA聚合酶的poly A聚合酶是适用于本发明的核酸聚合 终止反应的酶，所述poly A聚合酶是将腺苷结合于RNA的3'末端的酶。当使用这种酶 时，可以使用已知作为poly A聚合酶的抑制剂的3' -脱氧腺苷三磷酸（3' -dATP，虫草素 (cordycepin))〇
[0081] 在本发明中，步骤2)是灭活或消除步骤1)之后未反应的核酸聚合终止子的过程， 其中在灭活核酸聚合终止子时，可使用能够水解用在聚合中的各种核酸聚合终止子的三磷 酸键的所有各种酶。
[0082] 更具体而言，在灭活核酸聚合终止子时，核酸聚合终止子水解灭活，并且需要失去 该酶的功能，由此其优选容易受热失去活性。这是因为在随后的逆转录酶反应或PCR反应 中核苷三磷酸不应当降解。
[0083] 例如，磷键水解酶是具有降解三磷酸酯的底物性质的碱性磷酸酶，可以使用细菌 碱性磷酸酶（BAP)和小牛肠磷酸酶（CIP)等，并更优选地，可使用容易受热灭活的CIP。
[0084] 此外，可以使用水解焦磷酸酯、ATP等的来自各种有机体（即大肠杆菌、牛小肠和 虫下）的喊性憐酸酶，也可以使用 Autotaxin (Clair T.et al.，J. Biol. Chem. 272:996, 1997)。 可以使用非特异性降解核苷三磷酸的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)腺苷三磷 酸合成酶（AdsA)。
[0085] 根据本发明的用于制备核酸的方法可包括：进行用于分离并纯化核酸的过程，随 后，将核酸聚合酶和核酸聚合终止子添加到所提取的核酸中，从而终止互补核酸的聚合反 应，由此消除经由核酸的非特异性引发。反应之后，由于未反应的核酸聚合终止子起着随后 的聚合链式反应或PCR反应的抑制剂的作用，故需要消除未反应的核酸聚合终止子。
[0086] 可以使用凝胶过滤或离液剂和碳化娃（silicarbide)来消除核酸聚合终止子，但 本发明并不限于此。
[0087] 在根据本发明的制备核酸的方法中，可以使用已知的用于分析核酸的集成设备， 所述集成设备整体上管理已知的用于提取核酸的自动化设备和基因扩增设备，优选地，可 以使用Exiprep 16DX(Bioneer公司制造），但本发明并不限于此。
[0088] 更具体而言，进行用于分离并纯化核酸的过程，随后，将核酸聚合酶和核酸聚合终 止子添加到所提取的核酸中，从而进行核酸聚合终止反应，从而灭活所有核酸的引发功能。 由于反应之后剩余的终止子起着随后的逆转录酶反应或PCR反应的抑制剂的作用，所以可 使用两种方法来消除剩余的终止子。
[0089] 两种方法中的一种是通过使用Exiprep 16DX(Bioneer公司制造）再次进行RNA 纯化；另一种是降解核酸聚合终止子以使得反应不再进一步进行。
[0090] 通过各种步骤进行使用设备进行纯化的方法，所述方法是一种在离液剂的存在下 结合二氧化硅磁性颗粒、接着进行洗涤和洗脱过程的方法，这样该方法具有如下问题：需要 许多时间，且纯化的RNA可能在各种步骤中损失。同时，将作为经活化的核酸聚合终止子的 核苷三磷酸通过水解酶降解成二或单三磷酸酸酯来使其灭活的方法迅速而简单，且不会劣 化收率。
[0091] 将详细描述使用酶的灭活方法。由于在Exiprep 16DX的采集磁性颗粒的洗脱步 骤中使用的孔的温度是可控的，故用洗脱缓冲液洗脱孔，然后向孔中添加作为三磷酸酯水 解酶、自体毒素、金黄色葡萄球菌腺苷合成酶（ADsA)的碱性磷酸酶，并在37°C下反应，使得 可容易地消除终止子。
[0092] 作为具体实例，通过使用Exiprep 16DX(Bioneer公司制造）进行纯化的方法可使 用缓冲盒（buffer cartridge)。本发明的缓冲盒可由总共12个孔和一个样品试管组成。 孔①到⑩用于提取并纯化核酸，其构成如下：
[0093] 孔①是试剂混合并进行反应的孔，孔②是含有提取核酸所需的酶的孔，孔③是含 有进行血液、血清和培养细胞的细胞裂解的细胞裂解溶液的孔，孔④是含有用于将经洗脱 的核酸结合于硅珠的结合溶液的的孔，孔⑤含有用于结合核酸的硅珠的孔，而孔⑥是含有 用于消除剩余在硅珠中的污染物的初次洗涤溶液的孔，所述硅珠具有结合于其上的核酸。 孔⑦是含有用于消除剩余在硅珠中的污染物的二次洗涤溶液的孔，所述硅珠具有结合于其 上的核酸，孔⑧是含有用于消除剩余在硅珠中的污染物的三次洗涤溶液的孔，所述硅珠具 有结合于其上的核酸，孔⑨是含有枪头洗涤溶液的孔，所述枪头洗涤溶液用于干净地洗涤 核酸提取中使用的枪头，而孔⑩是含有用于将核酸从硅珠上洗脱的洗脱溶液的孔，所述硅 珠具有结合于其上的核酸。参见图9。
[0094] 更具体而言，将样品试管中包含的样品转移到孔①，并取孔③中包含的细胞裂解 溶液与孔②中包含的提取核酸所需的酶混合，然后转移到包含样品的孔①中。通过将温度 提升到60°C降解所有细胞，并将孔①中的所有溶液转移到含有核酸结合溶液的孔④并一起 混合。取所有反应溶液并转移到含有硅珠的孔⑤，将暴露在反应溶液中的所有核酸结合于 硅珠。在孔①中完全弃掉剩余的反应溶液而仅留下其上结合有核酸的硅珠。用孔⑥中包含 的初次洗涤溶液、孔⑦中包含的二次洗涤溶液和孔⑧中包含的三次洗涤溶液按顺序地洗涤 硅珠的表面，使得仅经纯化的核酸留在硅珠的表面上。对于最后的核酸提取而言，通过使 用枪头洗涤溶液来洗涤提取核酸中使用的枪头的表面，然后从含有核酸洗脱溶液的孔⑩取 核酸洗脱溶液，并与具有核酸的硅珠混合，从而从硅珠分离核酸，并用核酸洗脱溶液洗脱核 酸。
[0095] 取孔?中包含的所有poly (A)聚合酶和3' -dATP、反应溶液并转移到经洗脱的核 酸溶液中，接着在37°C下反应10分钟，从而完成在所提取的核糖核酸的3'末端处的终止反 应。这里，由于本反应中使用的3' -dATP抑制逆转录酶反应或PCR反应，故3' -dATP必然 应当被去除。为解决该问题，可采用以下两种方法。
[0096] 当参考图10解释时，全过程首先根据RNA提取和纯化、RNA终止来进行，然后为消 除在RNA终止中使用的3'-dATP的活性，进行以下两种方法，即通过RNA纯化消除3'-dATP， 或使用磷酸酶水解3' -dATP的三磷酸酯。
[0097] 第一种方法是使用在提取核酸中使用的反应剂的纯化方法，该方法是"通过RNA 纯化来消除3'-dATP的过程"。取进行RNA终止反应后获得的所有反应溶液和硅珠，并转移 到含有在核酸提取中使用的核酸结合溶液的孔④。剩余反应溶液全部弃去，而仅留下与核 酸结合溶液混合的硅珠以结合孔①中的核酸。通过使用孔⑧中包含的三次洗涤溶液来洗涤 硅珠的表面，使得仅经纯化的核酸留在硅珠表面上。然后，从含有核酸洗脱溶液的孔⑩取核 酸洗脱溶液，并与具有核酸的硅珠混合，从而从硅珠上分离核酸，并用核酸洗脱溶液洗脱核 酸。
[0098] 第二种方法是向进行了 RNA终止反应之后获得的反应溶液中加入碱性磷酸酶，以 消除存在于3' -dATP的5'末端的三磷酸酯残余物，从而防止在随后的PCR过程中的副反 应，所述方法为"使用碱性磷酸酶来水解3' -dATP的过程"。取进行了 RNA终止反应后获得 的所有反应溶液，并转移到含有碱性磷酸酶的孔?并充分混合在一起。取所混合的反应溶 液并转移到孔①，接着在37°C下反应10分钟，从而在消除ddATP的5'末端处的所有磷酸酯 残余物。为灭活反应中使用的碱性磷酸酶，将温度升高至65°C并进行反应10分钟。反应完 成后，仅取洗脱同时仅留下硅珠的所有核酸来用于PCR反应。
[0099] 另一方面，本发明还提供了一种用于聚合核酸的方法，所述方法使用用于核酸聚 合反应的核酸，其中所述核酸的3'末端结合核酸聚合终止子以防止非特异性核酸聚合。
[0100] 本发明提供了一种用于扩增核酸的方法，包括用于制备核酸的方法，其中用于制 备核酸的方法包括：1)通过使用含有核酸聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终止子的反应 混合物来终止所述核酸的3'末端；和2)从所述反应混合物中灭活或消除所述核酸聚合终 止子，所述反应混合物包含具有经终止的3'末端的核酸。
[0101] 在本发明中，所述扩增方法可用于热启动PCR、巢式PCR、多重PCR、逆转录酶 PCR(RT-PCR)、实时PCR、简并性寡核苷酸引物（DOP) PCR、定量RT-PCR和类似方法，以及普通 PCR反应。此外，所述扩增方法还可通过引物和核酸聚合酶的聚合反应的选择，应用于扩增 特异性碱基序列的信号的所有方法，从而用于检查聚合酶扩增的各种方法，例如等温滚环 扩增、使用逆转录的等温扩增等。
[0102] 另一方面，本发明提供了一种用于制备核酸的试剂盒，包括核酸聚合酶、酶反应缓 冲液和抑制核酸的3'末端延伸的核酸聚合终止子，所述核酸是用于制备在使用核酸聚合反 应来扩增和检测核酸中使用的核酸的方法中所需的。
[0103] 在本发明中，用于制备核酸的试剂盒可包括选自由以下物质构成的组的至少一种 作为核酸聚合酶：RNA依赖型RNA聚合酶、RNA依赖型DNA聚合酶、DNA聚合酶和RNA聚合 酶，并优选可包括poly (A)聚合酶。
[0104] 在本发明中，用于制备核酸的试剂盒可包括Tris-HCl、KC1、（NH4) 2SCV MgSOjP Triton X-100作为酶反应缓冲液。
[0105] 在本发明中，用于制备核酸的试剂盒可包括选自由以下物质构成的组中的至少一 种作为核酸聚合终止子：2' 3' -双脱氧核苷5' -三磷酸、3' -脱氧腺苷5' -三磷酸、3' -叠 氮-3' -脱氧胸苷5' -三磷酸、Ι-β-d-阿拉伯呋喃糖核苷酸5'-三磷酸、无环鸟苷三磷 酸、3' -氨基-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。
[0106] 在本发明中，用于制备核酸的试剂盒可进一步包括水解三磷酸酯的磷键水解 酶，所述磷键水解酶灭活核酸聚合终止子，其中作为磷键水解酶，也可使用选自由以下物 质组成的组中的至少一种：来自大肠杆菌、牛小肠和虾的碱性磷酸酶和自分泌运动因子 (autotaxin)〇
[0107] 所述试剂盒可包括操作指南。"操作指南"是一种说明试剂盒用法的印刷物，所述 用法例如，用于制备核酸制备用的试剂溶液的方法、要存在的制备条件等。操作指南包括在 诸如手册或样册之类的活页表面上的说明、贴于试剂盒的标签和包含试剂盒的包装。此外， 操作指南包括通过诸如因特网之类的电媒介出版或提供的信息。
[0108] 另一方面，本发明提供了一种用于纯化核酸的自动化设备，包括储存核酸聚合酶 和核酸聚合终止子的储存部分、以及将核酸聚合酶和核酸聚合终止子供给含有靶核酸的样 品的供给部分。
[0109] 在本发明中，储存部分可进一步包含三磷酸酯水解酶和酶反应缓冲液，且所述设 备可进一步包括计算机控制器以实现整体自动化。
[0110] 本发明提供了一种用于检查核酸的全自动装备，包括用于纯化核酸的自动化设 备。
[0111] 作为本发明的用于检查核酸的全自动装备，可使用已知的用于分析核酸的集成设 备，所述集成设备整体上管理用于提取核酸的已知制动化设备和基因扩增设备。优选地， 可使用本 申请人:开发的完全自动化地纯化、扩增和分析核酸的分析核酸用完全自动化装备 (韩国专利申请第10-2010-0086468号和第10-2012-0013757号）。作为实时基因扩增设 备，可使用已知的实时基因扩增设备。优选地，可使用韩国专利第10-794703号中公开的设 备、PCT/KR2008/064558中公开的设备或Bioneer公司制造的Exicycler 96实时定量热阻 块（Exicycler 96Real_Time Quantitative Thermal Block)，但本发明并不限于此。
[0112] 此外，本发明提供了一种用于聚合核酸的组合物，所述组合物包含被核酸聚合终 止子结合于3'末端以防止非特异性核酸聚合的核酸、Mg 2+离子、四种dNTP、DNA聚合酶和用 于扩增所述核酸的引物。
[0113] 用于聚合核酸的组合物可根据需要进一步包含引物、探针、荧光染料、逆转录酶 等。本文所使用的术语"核酸"没有限制，包括待扩增的模板核酸、DNA、RNA、DNA和RNA的 杂交物、其混合物、核酸提取物或核酸样品等。
[0114] 用于聚合核酸的组合物可进一步包含阻断寡核苷酸（blocking oligonucleotide)，所述阻断寡核苷酸具有与用于扩增模板核酸的引物互补的碱基序列和 被阻断的3'羟基。
[0115] 阻断寡核苷酸的碱基序列数量小于具有互补碱基序列的引物的碱基序列数量。当 如上所述阻断寡核苷酸的碱基序列的数量小于引物的碱基序列数量时，引物（或模板核 酸）阻断寡核苷酸键的熔解温度低于引物-模板靶DNA键的熔解温度。因而，引物和阻断 寡核苷酸在低温下通过双螺旋结构结合，然而，具有略低变性温度的阻断寡核苷酸在到达 引物的退火温度之前就解离，使得不再进一步形成双螺旋结构，这样在PCR反应中就不具 有效果，从而有效地用于热启动PCR。如上所述的使用阻断寡核苷酸的方法可以相同的方式 应用于探针。根据本发明的实施方式，优选阻断寡核苷酸具有比引物的熔解温度低1°C或更 多，优选2°C或更多的溶解温度，优选阻断寡核苷酸具有至少25°C或更高，优选50°C或更高 的熔解温度。
[0116] 此外，阻断寡核苷酸在3'末端缺乏羟基，或在3'末端具有除羟基外的其他取代 基。通过3'末端的羟基和5'末端的磷酸基相互结合的方式，DNA聚合方法进展，使得当3' 末端羟基被其他不同取代基所取代时，DNA聚合反应不再进一步进展。根据本发明的实施 方式，荧光物质（染料）、猝灭剂或由表1中所示的以下化学式表示的物质可用作取代基，然 而本发明并不限于此。
[0117] [表 1]
[0118]

【权利要求】
1. 一种使用核酸聚合反应来制备在扩增和检测核酸时使用的核酸的方法，所述方法包 括： 1) 通过使包括核酸、核酸聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终止子的反应混合物反应 来终止所述核酸的3'末端，所述核酸聚合终止子抑制所述核酸的3'末端的延伸；和 2) 从所述反应混合物中灭活或消除未反应的游离的核酸聚合终止子。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合反应通过引发而起始。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸聚合反应为选自由以下反应构成的组中 的至少一种：RNA依赖型RNA聚合酶反应、DNA依赖型RNA聚合酶反应、RNA依赖型DNA聚合 酶反应和DNA依赖型DNA聚合酶反应。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的核酸被分离并纯化以便能够终止反 应。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸为RNA或DNA，所述核酸聚合酶为选自由 以下物质构成的组中的至少一种：RNA依赖型RNA聚合酶、RNA依赖型DNA聚合酶、DNA聚合 酶和RNA聚合酶。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述RNA依赖型RNA聚合酶为来自黄病毒的NS5 酶。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述RNA依赖型DNA聚合酶为选自由以下物质构 成的组中的至少一种：MMLV逆转录酶、AMV逆转录酶和HIV逆转录酶。
8. 根据权利要求5所述的方法，其中所述RNA聚合酶为作为3'末端转移酶的poly (A) 聚合酶。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合终止子是类核酸化合物，所述类核 酸化合物以能够作用于所述核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，而无所述核酸的3'羟基的 羟基。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述类核酸化合物选自由以下物质构成的组中 的至少一种：2' 3' -双脱氧核苷5' -三磷酸、3' -脱氧腺苷5' -三磷酸、3' -叠氮-3' -脱 氧胸苷5' -三磷酸、1-0-d-阿拉伯呋喃糖核苷酸5'-三磷酸、无环鸟苷三磷酸、3' -氨 基-3' _脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述脱氧核苷三磷酸为选自鸟苷、腺苷、胸苷、 尿苷和胞苷中的至少一种。
12. 根据权利要求9所述的方法，其中所述步骤2)中灭活核酸聚合终止子为水解三磷 酸酯的磷键水解酶。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述磷键水解酶为选自由以下物质构成的组中 的至少一种：来自大肠杆菌、牛小肠和虾的碱性磷酸酶，和自分泌运动因子。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤2)中消除核酸聚合终止子是通过使用 凝胶过滤或离液剂来实现。
15. -种用于制备核酸的试剂盒，所述核酸是用于制备在使用核酸聚合反应来扩增和 检测核酸时使用的核酸的制备方法所需的，包括核酸聚合酶、酶反应缓冲液和核酸聚合终 止子，其中所述核酸聚合终止子抑制所述核酸的3'末端的延伸。
16. 根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述核酸聚合酶为选自由以下物质构成的组 中的至少一种：RNA依赖型RNA聚合酶、RNA依赖型DNA聚合酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶。
17. 根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述RNA依赖型RNA聚合酶为来自黄病毒的 NS5 酶。
18. 根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述RNA依赖型DNA聚合酶为选自由以下物 质构成的组中的至少一种：MMLV逆转录酶、AMV逆转录酶和HIV逆转录酶。
19. 根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶为作为3'末端转移酶的 poly(A)聚合酶。
20. 根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述核酸聚合终止子是类核酸化合物，所述 类核酸化合物以能够作用于所述核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，而无所述核酸的3'羟 基的羟基。
21. 根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述类核酸化合物选自由以下物质构成的组 中的至少一种：2'3'-双脱氧核苷5'-三磷酸、3'-脱氧腺苷5'-三磷酸、3'-叠氮-3'-脱 氧胸苷5' -三磷酸、1-0-d-阿拉伯呋喃糖核苷酸5'-三磷酸、无环鸟苷三磷酸、3' -氨 基-3' _脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。
22. 根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述脱氧核苷三磷酸为选自鸟苷、腺苷、胸 苷、尿苷和胞苷中的至少一种。
23. 根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括磷键水解酶，所述磷 键水解酶水解三磷酸酯并灭活核酸反应终止子。
24. 根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述磷键水解酶为选自由以下物质构成的组 中的至少一种：来自大肠杆菌、牛小肠和虾的碱性磷酸酶，和自分泌运动因子。
25. -种用于纯化核酸的自动化设备，包括储存核酸聚合酶和核酸聚合终止子的储存 部分；和向含有靶核酸的样品供给核酸聚合酶和核酸聚合终止子的供给部分。
26. 根据权利要求25所述的自动化设备，其中所述储存部分可进一步包含三磷酸酯水 解酶和酶反应缓冲液。
27. 根据权利要求25或26所述的自动化设备，其中所述设备进一步包括计算机控制器 以实现整体自动化。
28. -种用于检查核酸的全自动装备，包括根据权利要求27的用于纯化核酸的自动化 设备。
29. -种使用用于核酸聚合反应的模板核酸来聚合核酸的方法，其中核酸聚合终止子 结合于3'末端以防止非特异性核酸聚合。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸聚合终止子是类核酸化合物，所述类 核酸化合物以能够作用于所述核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，而无所述核酸的3'羟基 的轻基。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述类核酸化合物选自由以下物质构成的组中 的至少一种：2' 3' -双脱氧核苷5' -三磷酸、3' -脱氧腺苷5' -三磷酸、3' -叠氮-3' -脱 氧胸苷5' -三磷酸、1-0-d-阿拉伯呋喃糖核苷酸5'-三磷酸、无环鸟苷三磷酸、3' -氨 基-3' _脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。
32. 根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸聚合反应为选自由以下反应构成的组 中的至少一种：RNA依赖型RNA聚合酶反应、DNA依赖型RNA聚合酶反应、RNA依赖型DNA聚 合酶反应和DNA依赖型DNA聚合酶反应。
33. -种用于聚合核酸的组合物，包含被核酸聚合终止子结合于3'末端以防止非特异 性核酸聚合的模板核酸、Mg2+离子、4种dNTP、DNA聚合酶和用于扩增所述模板核酸的引物。
34. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述核酸聚合终止子是类核酸化合物，所述 类核酸化合物以能够作用于所述核酸聚合酶的三磷酸酯形式被活化，而无所述核酸的3'羟 基的羟基。
35. 根据权利要求34所述的组合物，其中所述类核酸化合物选自由以下物质构成的组 中的至少一种：2'3'-双脱氧核苷5'-三磷酸、3'-脱氧腺苷5'-三磷酸、3'-叠氮-3'-脱 氧胸苷5' -三磷酸、1-0-d-阿拉伯呋喃糖核苷酸5'-三磷酸、无环鸟苷三磷酸、3' -氨 基-3' _脱氧核苷酸5' -三磷酸和3' -氟-3' -脱氧核苷酸5' -三磷酸。
36. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物进一步包含阻断寡核苷酸，所述 阻断寡核苷酸具有与用于扩增模板核酸的引物互补的碱基序列和经阻断的3'羟基。
37. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸的碱基序列比具有互补碱 基序列的引物的碱基序列少5bp或更多。
38. 根据权利要求36所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸具有比所述引物的熔解温 度低1°C或更多的熔解温度。
39. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸具有至少25°C或更高的熔 解温度。
40. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述阻断寡核苷酸在3'末端羟基处具有除羟 基外的其他取代基。
41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述取代基选自由荧光物质（染料）、猝灭剂 或至少一种选自由以下化学式1至16表示的取代基的物质构成的组：

【文档编号】C12N15/11GK104350159SQ201380029805
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2012年4月9日
【发明者】朴翰浯, 李晙凞, 金悬书, 崔昭罗, 金锺勲 申请人:株式会社百奥尼