静默egfr表达的脱氧核糖核酸酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及静默EGFR表达的脱氧核糖核酸酶值NAzyme)。特定言之，本发明设及 一种专一性杂交至EGFRT790MRNA寡核巧酸。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子受体巧GFR)是一个表达于表皮的表面的穿膜蛋白，其在表皮修复 与再生上扮演重要的生理作用。表皮生长因子巧G巧为唾腺或其他与表皮表面相关腺体所 分泌的多肤，其与EGFR的细胞外域的特定区域结合。结合后，其产生一向细胞内传导的讯 息。第一个由于EGF结合导致的细胞内事件为EGFR细胞内域的构型改变，其使得5' -Ξ 憐酸腺巧（AT巧进入所谓的酪胺酸激酶（TK)域（其为一个含有酪胺酸残基的袋部），并 且贡献一憐酸基团至所述酪胺酸残基。所述带有憐酸化酪胺酸的细胞内EGFR变成能够 与其他细胞内蛋白质连结，并且能够启动一系列生化反应，其通过非常复杂的网络传导至 下游。此网络当中最为熟知的部分为活化后会导致癌细胞分裂的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)路径，W及活化后会增进细胞存活的AKT路 径。因此，EGFR活化的结果为增强细胞增生及强化细胞对不同干扰的耐受度。相较于邻近 正常细胞或其所源自的表皮表面，许多肿瘤过度表达EGFR或有突变型的EGFR，使其内在地 活化或具有对活化较强的感受性。此过度表达被认为是肿瘤细胞获得生长优势的许多机制 之一，其中获得生长优势是一恶性肿瘤表达型的特征。因此，阻断EGFR路径被认为是治疗 人类恶性肿瘤的合理策略。有两个基本的方法来抑制上游EGFR讯息路径：（1)通过利用专 一性的单株抗体从而避免EGF与其他天然肤配体结合至细胞外EGFR域，及（2)通过利用结 构上与袋部非常契合的小分子（亦即EGFR酪胺酸激酶抑制剂如gefitinib与erlotinib) 从而避免ATP与其他憐酸提供者进入细胞内EGFR域的酪胺酸激酶口袋。
[0003] 肺癌是癌症相关死亡的主要成因，且在当中非小细胞肺癌（NSCLC)占约85%。在 独特的NSCLC病患次群组中，肺癌细胞在EGFR带有活化性突变且惯常于异常EGFR讯息传 导的细胞存活。活化性突变中，EGFR的L858R突变与LREA剔除造成超过90 %的药物敏感 性突变，并且相较于野生型EGFR，对酪胺酸激酶抑制剂（TKI)有较强的结合亲合力。TKIs 的施用成功诱发EGFR突变的肺癌细胞内在的细胞调亡路径；但是，正常细胞的野生型EGFR 讯息的同步抑制作用，无可避免地引发剂量-限制性的副作用；例如皮肤红疹与腹泻。此 夕b尽管TKI在NSCLC-开始时的治疗上成功，在EGFR守口员残基790所导致的继发突变 灯790M，在50%抗药性病人当中可W发现），减弱TKI与EGFR之间的交互作用。剂量限制 毒性与T790M衍生的抗药性仍是NSCLC治疗上主要的待解决议题。
[0004]核糖核酸酶（r化ozymes)是自然存在的RNA分子，其含有使其较反义寡核巧酸有 效力的催化位置。然而，核糖核酸酶的更广泛用途由于其对化学性与酵素性降解的易感受 性及受限的目标位置专一性而受到阻碍。新一代的催化性核酸已被描述，其包含具有对特 定RNA序列有催化活性的DNA分子。相较于键头形的核糖核酸酶，此等DNA酶具有较佳的 催化效率（产生相较于自发性RNA分裂（RNAcleavage)速率快约1亿倍的速率增强），提 供较佳的受质专一性，对化学性与酵素性降解较有抗性，且其合成更为便宜。通过合理化设 计，能作用在特定mRNA使得基因的表达静默在转录子或对偶基因特定层级的核酸剂已被 全球许多实验室使用多年。在其当中，脱氧核糖核酸酶已被广泛地研究，W极佳结果静默多 种基因而作为治疗药剂。脱氧核糖核酸酶的基本结构是由两个受质结合臂侧翼于一催化域 组成，其中受质结合臂的序列与目标mRNA序列互补。脱氧核糖核酸酶在mRNA分裂位点对不 同的核巧酸组合物呈现不同的反应速率。此外，有别于需要切下酶（Dicer)蛋白从而形成 RNA诱发静默复合体巧ISC)来进行RNA分裂的siRNA，细胞质中富含的二价金属离子例如 Μ护或化2+足W催化脱氧核糖核酸酶的功能。结合运些因素，脱氧核糖核酸酶是便宜、稳定、 及易操作的核酸剂，且其有高效率的RNA分裂活性及在癌症治疗中具有低的非专一毒性。
[0005]GaryBeale等人提供一些核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶在Α431细胞中抑制EGFR 的表达（JournalofDrugTargeting,August2003V〇1. 11(7),卵.449 - 456)。然而，所述 先前技术指出运些核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶在抑制的效力上有较差的效果。化ispin R.化SS等人发表了记载脱氧核糖核酸酶在对抗癌症领域中兴起的回顾文章，其作为本文所 提及具前景的生物技术的预测（MolCancerTher2008 ;7(2) :243 - 51)。US20120225870 掲示一抗化bB或抗MET治疗可W是酵素性核酸例如核糖核酸酵素、催化性RNA(catalytic RNA)、酵素性RNA(emzymaticRNA)、催化性DMkatal}fticDM)、适体（aptamer)或适 体结合核糖核酸酶（aptamer-bindingribozyme)、可调节性核糖核酸酶（regulat油le ribozyme)、催化性寡核巧酸katal}fticoligonucleotides)、核酶（nucleozyme)、脱氧核 糖核酸酶值NAzyme)、RNA酵素（RNAenzyme)、核糖核酸内切酶（endoribonuclease)、核酸内 切酶（endonuclease)、微酶（minizyme)、引导酶（lea化yme)、寡酶（oligozyme)或DNA酵素 值NAenzyme)。然而，没有实质上酵素性核酸在此参考文献中提出。
[0006] 仍有发展能有效静默EGFR表达或克服TKI抗性且伴随较低有害副作用的脱氧核 糖核酸酶的需求。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR突变 mRNA从而抑制其转译。
[0008] 本发明提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRT790M mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有选自由SEQIDN0:1至7组成的群的序 列的连续核巧酸。
[0009] 本发明更提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR E746-A750缺失的mRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有SEQIDN0:8的序列 的连续核巧酸。
[0010] 本发明更提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFR L858RmRNA从而抑制其转译，其中所述寡核巧酸包含具有选自由SEQIDNO: 9至15组成的 群的序列的连续核巧酸。
[0011] 本发明也更提供一种载体与宿主，其包含编码本发明的寡核巧酸或其修饰序列的 序列的载体。
[0012] 本发明也提供一种医药组合物，其包含本发明的寡核巧酸或其修饰序列、载体或 宿主及医药上可接受的载剂。
[0013] 本发明也更提供一种专一性地分裂EGFR突变mRNA或抑制EGFR突变mRNA表达的 方法，其包含使本发明的寡核巧酸或其修饰序列在容许所述分子分裂所述mRNA或抑制所 述mRNA表达的条件下接触所述mRNA。
[0014] 本发明也更提供在个体中治疗EGFR-依赖性癌症的方法，其包含对个体施用一有 效量的本发明的寡核巧酸或其修饰序列。
[0015] 本发明也更提供一种在个体中治疗EGFR-依赖性癌症的方法，其包含对个体施用 TKI抑制剂或EGFR专一性抗体，W及本发明的寡核巧酸或其修饰序列。
[0016] 本发明发展一种脱氧核糖核酸酶，其能压制EGFR对偶基因专一性层次上的表达。 此抗EGFR突变（尤其是T790M)的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶，能减量（knockdown) EGFRmRNA表达同时维持EGFR野生型mRNA的完整性。因此，此抗EGFR突变（尤其是T790M) 的对偶基因专一性的脱氧核糖核酸酶可克服EGFR突变-驱动的TKI抗药性并且伴随降低 EGFR-依赖性癌症（如非小细胞肺癌）病患的正常细胞中不希望的副作用。本发明的脱氧核 糖核酸酶与TKI抑制剂或EGFR专一性抗体结合使用，对于治疗EGFR-相关癌症，如NS化C， 提供了协同（synergistic)效果。
[0017] 术语「一」是指一或大于一（即，至少一）的本文文法上的目标。
[0018] 术语「核酸」是包含但不限于任何核酸，包含脱氧核醋核酸、核醋核酸、寡核巧酸、 聚核巧酸及其类似物或衍生物。所述形成核酸的核巧酸可为其类似物或衍生物。核酸中可 并入（inco巧orate)非核巧酸。
[0019] 术语「核巧酸」是包含但不限于核巧酸及其类似物或衍生物。举例来说，核巧酸可 能包含碱基A、C、G、T和U，W及其衍生物。运些碱基的衍生物为所属技术领域所熟知，并 WPCR系统、试剂和耗材为例。（PerkinElmerCatalogue1996-1997,RocheMolecular Systems,Inc. ,Branchburg,N.J. ,USA)。
[0020] 术语「核酸酶」是指核酸分子，其能催化化学反应。所述核酸酶能与其它一个或 更多的分子共价结合而维持核酸酵素形态。W其它分子举例来说，其包括染剂、遮蔽物 (quenchers)、蛋白质和固体的支撑。核酸酶可全由核醋核酸、脱氧核醋核酸或是合并核醋 核酸和脱氧核醋核酸来组成。
[0021] 术语「脱氧核糖核酸酶」是指能切断单股和双股目标序列的单股聚核巧酸。
[0022] 术语「治疗」或「诊治」是指在哺乳动物进行疾病的治疗，包括（a)避免疾病，即不 发生临床症状；化）抑制疾病，即，阻止、改善、减缓或压制临床症状的发展；W及/或（C)解 除疾病，即使临床症状复原。属医学技术领域者所知悉，应都能了解很难区别「预防」和「抑 审IJ」的差别，原因在于最终结果或未知情形事件、潜在状况或病人还不明了直至发生任何事 件。因此，术语「预防性治疗」的定义指的是「治疗」的一部份，从而包含「预防」和「抑制」。 本文在此使用的术语「保护」意含包括了「预防性治疗」。
[0023] 术语「有效量」是指足W提供治疗疾病的足够剂量或病况被治疗的剂量。其依据 病人、疾病和治疗的影响而会有所不同。
[0024] 术语「施用」是指根据所属技术领域中具有通常知识者习知的任何各种方式与输 送系统来施用。所述施用可通过例如植入式、经黏膜地、经皮地及皮下地执行。在一较佳实 施例中，所述施用为局部且较佳为经皮施用。
[0025] 术语「杂合」是指一单股核酸分子基于序列互补性与另一核酸分子黏着 (anneal),核酸分子间的杂合的倾向取决于其周围环境的溫度与离子强度、核酸分子的长 度及其互补程度，运些参数对杂合的影响为所属领域所熟知。
[0026] 术语「抑制」是指减缓、停止或者阻碍。
[0027] 术语「医药上可接受的载剂」是指任何所属技术领域中具有通常知识者所习知的 各种载剂。在一实施例中，所述载剂为醇（alcohol),较佳地为丙二醇（et的leneglycol)。 在另一实施例中，所述载剂为微脂体（liposome)。下面所陈述的医药上可接受的载剂，其和 最常见相关的输送系统有关，通过实例了解到实际上所述医药上组合物较佳为经皮输送。 [002引术语「专一性分裂」当设及催化性核酸分子在目标mRNA分子上的作用时，是指分 裂所述目标mRNA分子，而不分裂其他与催化性核酸分子的两个结合域序列不互补的mRNA 分子。
[0029] 术语「个体」是指任何动物，例如人类、灵长类、老鼠、大鼠、天竺鼠或兔子。
[0030] 术语「载体」应包括但不限于能用于稳定将专一性核酸序列引入生物体的基因体 的核酸分子
[0031] 下列的缩写应具有下面所示的意义：「A」是指腺嚷岭；「bp」是指碱基对；「C」是指 胞喀晚；「DNA」是指脱氧核糖核酸；「G」是指鸟嚷岭；「mRNA」是指讯息核糖核酸；「RNA」是 指核糖核酸；「RT-PCR」是指反转录酵素聚合酶链锁反应；「RY」是指嚷岭：喀晚；「T」是指胸 腺喀晚；「叫是指脈喀晚。
[0032] 在一态样中（一方面），本发明提供一种寡核巧酸或其修饰序列，其专一性地杂合 至EGFR突变mRNA,从而抑制其在细胞中的转译。在一具体实施例中，所述EGFR突变为EGFR G719、E746-A750缺失、T790、L858、D761、V765及T783。在一较佳具体实施例中，本发明提 供一种寡核巧酸或其修饰序列，其在细胞中专一性地杂合至EGFRT790MmRNA从而抑制其 转译，其中所述寡核巧酸或其修饰序列包含具有选自由SEQIDN0:1至7组成的群的序列 的连续核巧酸。
[003引SEQIDNO: 1至7的序列如下所示：
[0034]DzT790M-l:AGCTGCATGAGGCTAGCTACAACGAG