大肠杆菌2-脱氧-d-核糖-5-磷酸醛缩酶突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷 酸醛缩酶突变体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA)，编号为EC4. 1. 2. 4,能够催化 5-磷酸-2-脱氧-D-核糖分解成3-磷酸-D-甘油醛和乙醛，并可催化其逆反应。
[0003] 易错PCR是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶 固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入 到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。
[0004] 通过易错PCR法获得酶活力更高的DERA突变体成为一种改造DERA酶的有效手 段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶（DERA)突变 体及其制备方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶突 变体，其为：1)由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或2)SEQIDNo. 1所示氨基 酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
[0007] 本发明还提供编码所述DERA突变体酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 不。
[0008] 本发明还提供含有编码所述DERA突变体酶的基因的载体、宿主细胞和转基因工 程菌。
[0009] 本发明还提供含有编码所述DERA突变体酶的基因的大肠杆菌工程菌。
[0010] 本发明进一步提供所述DERA突变体酶的制备方法，将含有编码所述DERA突变体 酶的基因的大肠杆菌工程菌接种于LB培养基中，37°C，180rpm培养8-10h，按3%的接种量 接种于盛有3L发酵培养基的发酵罐中，发酵罐容积为5L，在37 ± 1 °C，300rpm，空气流量4L/ min的条件下培养8-10h后，添加60%甘油作为补料，当0D600达到30时，降温至30°C，添 加0.ImMIPTG进行诱导，诱导10h后，放罐，离心发酵液，收集菌体，加入3倍体积pH7. 5的 50mM碳酸氢钠缓冲液，冰水浴超声破碎，8000rpm离心取上清，即得含有所述DERA突变体的 粗酶液。
[0011] 所述发酵培养基为：甘油4g/L，磷酸氢二钾12. 8g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵 〇? 5g/L，氯化钙 0? 0152g/L，氯化镁 0? 41g/L。
[0012] 经酶活力测定，本发明提供的大肠杆菌DERA突变体酶较野生型DERA酶活可提高 3. 8个活力单位。通过对含有编码所述DERA突变体的基因的大肠杆菌工程菌进行大规模发 酵，可实现大肠杆菌DERA突变体酶的批量生产。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明实施例1中PCR扩增DERA基因的电泳检测结果；其中，M为DNA Marker，1和2为目的DERA基因。
[0014] 图2为本发明实施例1中质粒pET-DERA的酶切电泳图；其中，M为DNAMarker，1 为酶切后的pET-DERA。
[0015] 图3为本发明实施例3中DERA突变体的SDS-PAGE电泳检测图；其中，M为蛋白 Marker，1为细菌裂解液。
[0016] 图4为本发明实施例4中DERA酶活力测定原理示意图。
[0017] 图5为本发明实施例7中DERA突变体酶催化反应产物的GC分析结果。
【具体实施方式】
[0018] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0019] 实施例1质粒pET-DERA的构建方法
[0020] 1、PCR扩增DERA基因
[0021] 以1yg大肠杆菌基因组DNA为PCR反应模板，设计引物A1 :5'-AAAAACATATGACT GATCTGAAAGCAAGCA-3'和引物A2 :5' -AAAAACTCGAGTTAGCTGCTGGCGCTCTTAC-3 '，进行PCR 扩增。PCR反应在50y1总体积中进行，反应条件为：94°C变性5min;94°C变性50s，55°C退 火lmin，72°C延伸2min，共30个循环；最后72°C延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶 电泳检测，结果见图1。
[0022] 2、DERA表达质粒的构建
[0023] 凝胶回收PCR扩增产物，用NdeI和XhoI双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeI 和XhoI双酶切的pET_42a载体连接（于16°C连接16h)，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞， 挑选阳性克隆，提取质粒后进行双酶切分析验证，结果如图2所示，并进行DNA测序鉴定，插 入序列正确的质粒命名为pET-DERA。
[0024] DERA的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示，核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0025] 实施例2构建DERA突变体酶文库
[0026] 使用随机诱变试剂盒，通过改变MnCl2浓度和dNTPs浓度来进行多个反应，从而将 多个点突变引入E.coliDERA基因中。
[0027] 易错PCR所用引物为Al:5 ' -AAAAACATATGACTGATCTGAAAGCAAGCA-3 '和A2 : 5 ^ -AAAAACTCGAGTTAGCTGCTGGCGCTCTTAC-3'，易错PCR总体为 50y1，反应条件为：94°C变 性4min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环；最后72°C延伸10min。 将易错PCR片段用NdeI和XhoI双酶切，回收酶切片段，与同样用NdeI和XhoI双酶切 的pET-42a载体连接，构建成表达文库，选取10个单克隆。然后将表达文库质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，用于表达突变的DERA基因。
[0028] 实施例3DERA突变体酶的表达
[0029] 突变DERA基因的表达：将实施例2中获得的突变菌，挑取单克隆接种至5mlLB培 养基中（含50yg/ml的卡那霉素），37°C，200rpm培养6-8h，0D6QQ= 0. 6-0.8时，加入终浓 度为0. 5mM的IPTG，30°C诱导表达10h后冰浴超声破碎菌体，细菌裂解液经SDS-PAGE电泳 检测，结果如图