基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法与流程

本发明涉及生物领域，特别涉及一种基于亚硫酸氢盐测序法的foxp3基因甲基化检测方法。

背景技术：

foxp3是调节性t细胞(regulatorytcell,treg)的特征性标志，在维持免疫耐受过程中发挥重要作用。近年来研究证实：foxp3基因的表达和蛋白功能的发挥均与表观遗传学(如dna甲基化、翻译后修饰等)密切相关。亚硫酸氢盐测序法是国内外学者公认的脱氧核糖核酸(dna)甲基化位点检测金标准，可准确而灵敏地检测出特定dna序列不同胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cpg)位点的甲基化状态，但是受实验过程中诸多因素(如样本保存条件、基因组dna含量及纯度、转化后基因组dna含量、pcr反应体系、甲基化引物序列、蓝白克隆筛选等试验因素)的影响成功率低下。

技术实现要素：

本发明建立了一种基于亚硫酸氢盐测序法的foxp3(forkhead/wingedhelixtranscriptionfactor,foxp3)基因甲基化检测方法。

作为本发明的一个方面，提供了一种基于亚硫酸氢盐测序法的foxp3基因甲基化检测方法，包括：

步骤1，用促凝采血管收集人静脉血4ml，室温凝固30min，离心1000g×15min，而后分装1ml血凝块进1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中。

步骤2，采用血液基因组dna提取试剂盒提取血凝块基因组dna。

步骤3，通过0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳初步确定基因组dna完整性、浓度和纯度，并将检测合格的dna样本置于-20℃冰箱备用。

步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组dna，并将修饰好的dna样本置于-20℃冰箱备用。

步骤5，在确定的实验条件下进行甲基化pcr扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)鉴定pcr产物，凝胶成像系统观察、拍照，并将回收完毕的目的pcr产物置于-20℃冰箱备用；所述确定的实验条件是：pcr模板量为10μl转化后的基因组dna，pcr采用50μl反应体系和4μl的25mmol/lmgcl2，扩增产物长度为111bp。

步骤6，pcr产物通过2％琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)鉴定，凝胶成像系统观察、拍照。

步骤7，采用dna纯化回收试剂盒纯化回收步骤5中的18μlpcr产物，通过载体连接将2μlpcr纯化回收产物转化入trans1-t1感受态细菌中，开展蓝白克隆斑筛选，并以通用引物(m13f和m13r)做pcr扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)分离，凝胶成像系统观察、拍照，以鉴定阳性克隆。

步骤8，选取步骤7中阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/ml卡那霉素单抗lb液体培养基中，在37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h后，取变浑浊的样本送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序部进行测序。

优选地，所述步骤5中进行pcr扩增的引物序列为：

f:5’-atttttaggatttgaggttttaata-3’，

r:5’-caaaaaacccactaaaaaactatac-3’。

优选地，所述步骤5中进行甲基化pcr扩增时的反应条件为：

步骤a，94℃预加热3min；

步骤b，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；

步骤c，重复上述步骤b中的循环35次；

步骤d，72℃保持7min后，4℃保存。

优选地，所述步骤5所确定的pcr实验体系为：4μl的25mmol/lmgcl2。

优选地，所述步骤1中的血液采集方法为用促凝采血管收集人静脉血。

优选地，所述步骤1中收集的静脉血在室温凝固30min，离心1000g×15min，而后分装1ml血凝块进1.5mlaxygenpe管。

优选地，所述步骤1中的血凝块保存条件为：-80℃冰箱。

优选地，所述步骤2中的dna提取试剂盒为：北京市天根生物有限公司血液基因组dna提取试剂盒(货号：dp348)。

优选地，所述步骤3中的初步确认基因组dna完整性、浓度和纯度的方法为：0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳法(130v，40min)。

优选地，所述步骤3中检测到的基因组dna浓度为：5-20ng/μl。

优选地，所述步骤3中基因组dna保存条件为：-20℃冰箱。

优选地，所述步骤4中用于转化的基因组dna含量为：100-400ng。

优选地，所述步骤4中甲基化转化试剂盒为美国天漠公司产品(货号：d5006)。

优选地，所述步骤4中转化后的基因组dna保存条件为：-20℃冰箱。

优选地，所述步骤5的pcr模板量为10μl转化后的基因组dna(即转化后的全部基因组dna)。

优选地，所述步骤5的甲基化pcr采用50μl反应体系。

优选地，所述步骤5的扩增产物长度为111bp。

优选地，所述步骤5的pcr产物鉴定方法：2.0％的琼脂糖凝胶电泳法(130v，40min)。

优选地，所述步骤6的用于纯化回收试验的pcr产物体积为18μl。

优选地，所述步骤6的蓝白克隆斑筛选试验所用的试剂盒为：北京全式金生物科技有限公司ta克隆试剂盒(货号：ct101-02)。

优选地，所述步骤6的用于蓝白克隆斑筛选试验中的pcr纯化回收产物的体积为2μl。

优选地，所述步骤6的蓝白克隆斑筛选试验所用的抗生素为卡那霉素。

优选地，所述步骤6鉴定阳性克隆的方法为：通过通用引物(m13f和m13r)做pcr扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳法(130v，40min)鉴定。

优选地，所述步骤7阳性克隆培养条件为：在50μg/ml卡那霉素单抗lb液体培养基中37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h。

本发明通过完善血液样本保存条件、基因组dna浓度及纯度检测方法、转化后基因组dna含量、pcr反应体系中不同成分的终浓度、甲基化引物序列特异性、蓝白克隆筛选条件等试验因素，成功地建立基于亚硫酸氢盐测序法的foxp3基因甲基化检测方法，能成功地检测出foxp3基因启动子区特定序列5个cpg位点甲基化的程度，从整体上提高试验的准确性和可重复性。

附图说明

图1示意性地示出了样本基因组dna电泳图；

图2示意性地示出了甲基化pcr扩增产物电泳图；

图3示意性地示出了蓝白克隆斑筛选图；

图4示意性地示出了阴性重组子和阳性重组子pcr产物电泳图；

图5示意性地示出了foxp3基因启动子区特定序列测序图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

foxp3是treg细胞的特征性标志，在维持免疫耐受过程中发挥重要作用。近来发现foxp3基因的表达和蛋白功能的发挥均表现为dna序列变异以外的调控机制即表观遗传学，包括dna甲基化、组蛋白修饰和翻译后修饰等。dna甲基化以胞嘧啶甲基化发生频率最高。胞嘧啶甲基化是指在dna甲基转移酶的催化下以s-腺苷蛋氨酸为供体将甲基加在胞嘧啶5’的位置上形成5-甲基胞嘧啶的反应。部分位点是胞嘧啶和鸟嘌呤以磷酸酯相连而形成的cpg位点。影响基因表达的cpg位点主要位于基因的启动子和第一外显子区域。当特定基因启动子区cpg位点高甲基化，可直接阻碍转录因子与启动子结合，从而使基因不能转录或转录水平降低；相反，cpg位点的低甲基化则会导致染色质疏松，从而增加目的dna序列的易接近性，使得特异性转录因子更容易与其连接。foxp3基因座含有多个cpg位点。位于启动子和第一外显子的cpg位点甲基化程度与foxp3基因的表达密切相关，是t细胞分化过程中许多因子调节的关键靶点。

本发明摸索foxp3基因亚硫酸氢盐测序，成功检测出人foxp3基因启动子区特定区域(+2071，+2182)5个cpg位点的甲基化状态，具体实验过程如下：

1.材料与方法

1.1材料与试剂

促凝采血管购自广州健福医疗科技有限公司。

用促凝采血管收集健康工人静脉血4ml，室温凝固30min，离心1000g×15min，而后分装1ml血凝块进1.5mlaxygenpe管，保存于-80℃冰箱中，以防止基因组dna的降解导致实验失败。

血液基因组dna提取试剂盒购自中国北京市天根生物有限公司，卡那霉素和ta克隆试剂盒购自中国北京市全式金生物科技有限公司；

正常熔点琼脂糖购自西班牙biowest公司；

taq酶、dna甲基化转化试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒分别由美国fermentas公司、美国天漠公司和美国omega公司提供；

甲基化pcr引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；

其余试剂为国产分析级试剂。

1.2甲基化引物设计

结合ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)和ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)的资料查找foxp3基因启动子序列，使用methprimer在线分析软件(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)进行引物设计，再到bisearch数据库(http://bisearch.enzim.hu/index.php？m＝genompsearch)验证引物。引物序列如表1，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

表1foxp3基因甲基化引物信息

1.3基因组dna的制备：

采用血液基因组dna提取试剂盒提取血凝块基因组dna，通过0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)初步确定基因组dna完整性、浓度和纯度，并将检测合格的dna样本置于-20℃冰箱备用。

1.4基因组dna亚硫酸氢盐转化

采用甲基化转化试剂盒修饰100-400ng基因组dna，并将修饰好的dna样本置于-20℃冰箱备用。

1.5甲基化pcr扩增

pcr模板量为10μl转化后的基因组dna(即转化后的全部基因组dna)，pcr采用50μl反应体系，扩增产物长度为111bp，引物序列及其它组分终浓度均不变，详见表2。

pcr反应条件：94℃预加热3min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；重复上述循环35次。然后，72℃保持7min后，4℃保存。

pcr扩展产物均采用2％琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)分离，凝胶成像系统观察、拍照。也可根据琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书的操作步骤回收18μl目的pcr产物。将回收完毕的目的pcr产物置于-20℃冰箱待用。

表2甲基化pcr反应体系

1.6目的基因的克隆及筛选

2μl(约50ng)pcr纯化回收产物与载体连接，转化入trans1-t1感受态细菌中，采用卡那霉素抗性，开展蓝白克隆斑筛选试验；以通用引物m13f和m13r做菌落pcr扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳(130v，40min)分离，凝胶成像系统观察、拍照，以鉴定阳性克隆。

1.7测序

选取阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/ml卡那霉素单抗lb液体培养基中，37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h后，取变浑浊的样本送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序部进行测序。

2.结果

2.1基因组dna1％琼脂糖凝胶电泳结果

如图1所示，大部分样本甬道在dna标记物15000bp条带的上方可见明亮的目的条带，此条带即基因组dna，其大小与预期结果一致，部分条带可见拖尾。

其中：

m：dna标记物；

1：样本基因组dna；

2.2甲基化pcr2％琼脂糖凝胶电泳结果

空白对照甬道未见条带，样本甬道在dna标记物100bp-250bp条带之间出现明亮而清晰的目的条带，其长度与foxp3基因甲基化pcr产物长度111bp相吻合，见图2。

其中：

m：dna标记物；

1：空白对照；

2：样本甲基化pcr产物；

2.3蓝白克隆斑结果

阴性组未见蓝斑或白斑，样本组可见白色或蓝色圆形光滑单一菌落。其中，白色菌落为有foxp3基因甲基化pcr产物插入的质粒转化菌落(阳性重组子)，蓝色菌落为空质粒转化菌落(阴性重组子)，具体详见图3。

2.4pcr鉴定阳性克隆分析

阳性重组子(即阳性克隆)的pcr产物长度应为插入的foxp3基因甲基化pcr产物(111bp)和部分t载体(199bp)序列之和，长度应为310bp；阴性重组子(即阴性克隆)的pcr产物长度应为部分t载体序列长度199bp。2％琼脂糖凝胶电泳结果显示，白色菌落甬道在dna标记物250bp和500bp条带之间出现明亮而清晰的目的条带，而蓝色菌落甬道在dna标记物100bp和250bp条带之间出现目的条带，见图4。这证实白色菌落即阳性重组子，而蓝色菌落即阴性重组子。

其中：

m：dna标记物；

1：阴性重组子；

2：阳性重组子；

3：空白对照。

2.5克隆的测序结果

测序结果与人foxp3基因启动子区特定dna序列(+2071，+2182)比对，目的片段无突变，5个cpg位点的胞嘧啶均未被亚硫酸氢盐修饰，最后显示为胞嘧啶，表明该样本外周血foxp3基因启动子特定区域所有cpg位点呈现高甲基化，见图5。

图5测序后显示人foxp3基因启动子区特定序列5个cpg位点高甲基化。

通过上述验证例可知，本发明研究设计甲基化引物，确定整个实验过程的各项条件，建立了基于亚硫酸氢盐测序法的foxp3基因甲基化检测方法。

发明人采用本发明中的方法反复进行了多次试验，均可获得理想的扩增产物。测序结果表明，亚硫酸氢盐转化完全，样本外周血foxp3基因启动子区特定区域的5个cpg位点均为高甲基化。

可见，本发明建立了亚硫酸氢盐测序法的foxp3基因甲基化检测方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。