简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因检测领域，具体涉及一种可适用于石蜡包埋样本等低质量样本 的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基 化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着 至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA 甲基化检测的金标准全基因组重亚硫酸盐测序WGBS或BS-Seq(Whole genome bisulfate sequencing)[1]，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏 度。然而，正是由于BS-Seq能够对全基因组甲基化检测，也导致了测序深度高、测序费用高 等弊端。
[0003] 2005 年AlexanderMeissner等[2]在NucleicAcidsResearch首次提出简化的 表观重亚硫酸氢盐测序技术（RRBS，ReducedRepresentationBisulfiteSequencing)，该 方法通过MspI酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，同时实现CpG位点 的单碱基精度检测的高分辨率和测序数据的高利用率。RRBS作为一种高性价比的甲基化研 究方法，可以实现多个样本的比对基因组分析，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应 用前景。
[0004] 目前，RRBS测序技术主要用于人和小鼠，需要2-5ug基因组DNA起始构建文库。传 统的RRBS文库构建方法如下：
[0005] (1)gDNA酶切：2 ~5μg基因组DNA起始量，采用MspI酶切gDNA，QIA-quickPCR PurificationKit过膜纯化；
[0006] (2)末端修复：以dNTP为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和 Klenow片段对酶切后的粘性末端修复成平末端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯 化；
[0007] (3)加"A"：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow片段（3'-5'ex〇-)为平末端3' 端加A，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
[0008] (4)加"甲基化接头":采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA 片段两端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化；
[0009] (5)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收150-325bp范围内的片段，QIA-quick GelExtractionKit进行胶纯化回收；
[0010] (6)重亚硫酸氢盐处理：加入一定比例λ-DNA至胶回收产物作为对照，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit对胶回收产物进行Bisulfite反应；
[0011] (7)PCR扩增：米用ΚΑΡΑHiFiHotStartUracil+ReadyMix对Bisulfite产物进 行PCR扩增，扩增产物Ampure磁珠纯化，文库构建完成；
[0012] (8)文库质控：对文库进行2100峰图和QPCR质控，合格后高通量测序；
[0013] (9)上机测序：根据需求选择测序策略和测序数据量。
[0014] RRBS测序技术的高性价比赢得了科研工作者的青睐，特别在多样本分析方面得到 广泛的应用，取得了较好的成效。然而，在实际应用过程中，RRBS也显示出一定的局限性， 存在的主要问题是：
[0015] (1)对于石蜡包埋样本或其他低质量样本，数据浪费严重，数据利用率低；
[0016] (2)RRBS建库一般要求起始样本的gDNA量为2~5μg，这使得珍贵的（一般而言 都是少量的）临床样本，很难达到建库起始量的要求。
[0017] 参考文献
[0018] [1]Li, N. , et al. , Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology. Methods. 2010. 52(3):p. 203-12.
[0019] [2] Alexander Meissner, Andreas Gnirke, George W. Bell, et al. Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 2005, 33(18):5868-5877.
【发明内容】
[0020] 鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够适用于石蜡包 埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。
[0021] 本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在末端修复步骤中使 用dCTP、dGTP与dATP的适当比例的混合物代替传统的dNTP提供单脱氧核糖核苷酸、且将 末端修复步骤与加A步骤合并进行，可是实现适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化 的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，从而完成了本发明。
[0022] 即，本发明包括：
[0023]1.-种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：
[0024] 步骤A:用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；
[0025] 步骤B:将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其 中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中 dCTP:dGTP:dATP的摩尔比为1:1:5~1:1:20，且该混合物中不包含dTTP;
[0026] 步骤C:将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片 段；
[0027] 步骤D:将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢 盐处理产物；
[0028] 步骤E:所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0029] 步骤F:将所述PCR扩增产物进行片段筛选。
[0030] 2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA的量为50~500ng。
[0031] 3.根据项1或2所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA来自于低质量样 本。
[0032] 4.根据项3所述的方法，其中，所述低质量样本是石蜡包埋样本。
[0033]5.根据项1~4中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中的所述混合物中，dCTP: dGTP:dATP的摩尔比为 1:1:9 ~1:1:11。
[0034] 6.根据项1~5中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中采用包含所述酶切产 物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修 复及3'端加A;
[0035] 反应条件为30~50°C、0. 5~12小时。
[0036] 7.根据项1~6中任一项所述的方法，其中，所述步骤C中采用包含所述3'端加 A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化 接头；
[0037] 反应条件为10~30°C、0. 5~5小时。
[0038] 8.根据项1~7中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B 与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。
[0039] 9. -种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒，其用于实施项 1~8中任一项所述的方法，其包括：
[0040] 用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合 物，该混合物中dCTP:dGTP:dATP的摩尔比为1:1:5~1:1:20,且该混合物中不包含dTTP。
[0041] 10.根据项9所述的试剂盒，其还包括选自下组中的至少一种或全部：
[0042] 用于对所述基因组DNA进行MspI限制性内切酶处理的试剂；
[0043] 用于所述3'端加A的试剂；
[0044] 用于将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头的试剂；
[0045] 用于对所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理的试剂；
[0046] 用于对重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增的试剂；和
[0047] 用于将所述PCR扩增产物进行片段筛选的试剂。