基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，尤其是组合合成技术，具体涉及一种基于组合合成技 术合成可控的人源化抗体库的方法与应用。
【背景技术】
[0002] 抗体是机体受抗原刺激后由B淋巴细胞产生，能特异性结合或识别入侵的病源微 生物，是体液免疫应答中发挥免疫功能的最主要的免疫分子，主要分布于血清中。抗原往往 具有多种不同抗原决定簇，从而刺激机体产生多克隆抗体；这种抗体是不均一的，会影响检 测抗原的特异性及敏感性，在临床上应用受到很大限制。
[0003] 20世纪70年代中期B淋巴细胞杂交瘤技术问世，由此制备出的单克隆抗体是抗单 个抗原决定簇的抗体，具有高度的特异性和均一性，且亲和力强、效价高，在临床上发挥了 重要作用。然而，单克隆抗体在临床和生产中也存在一些问题，主要包括单克隆抗体具有免 疫原性，半衰期短，生产复杂，价格较高等问题。
[0004] 随着人们对抗体基因结构与功能的深入了解和分子生物学技术的发展，应用DNA 重组和蛋白质工程技术可以按人们的意愿在基因水平上对抗体分子进行切割，拼接或修 饰，重新组装成新型抗体分子，并赋予抗体分子新的生物学活性。因此基因工程抗体比天然 抗体具有更广阔的应用前景。
[0005] 例如，为了解决抗体的穿透性问题，可对抗体进行改造，保留其抗原结合位点，使 之成为小分子抗体如单链抗体：将抗体的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)用连接肽 (linker)连接，形成具有抗原结合能力的单链抗体多肽，即所谓的单链抗体（singlechain variablefragment，ScFv)，单链抗体的大小仅为完整抗体的1/6,免疫原性弱，药物动力学 优于Fab片段和完整抗体，能有效到达完整抗体无法到达的靶部位。因此单链抗体是目前 报道最多，也最有发展前景的基因工程抗体。
[0006] 单克隆抗体技术是21世纪以来生物医药领域最为热门的研究方向之一，单抗类 药物直接与抗原（致病因子、肿瘤细胞等）发生特异性结合，与传统化学药物给药相比，其 在临床上具有靶向性、副作用小、疗效高、抗药性小等优势。在过去十几年中，全球单抗药物 市场增长迅速，2012年全球单抗药物上市品种46个，市场总额约570亿美金，占同期全球 药品市场份额的6. 7%。由于单抗药物相对于化疗药物的优势明显，靶向治疗的理念越来越 被接受，其强劲的市场需求成为全球制药企业争夺的焦点，目前几乎所有大型制药公司都 有单克隆抗体研发项目。
[0007] 传统单抗制备利用杂交瘤技术，通过脾细胞融合得到稳定单抗株，至少需要花费 数月时间，并且单抗筛选范围相对窄，严重影响了高亲和力人源单抗的制备。传统单抗本身 都是鼠源单抗，鼠抗体的人源化虽然已有很多成功的报道，也有得到批准上市的抗体，但仍 然存在以下问题：难以避免人抗鼠抗体反应，并且在鼠抗人源化过程中亲和力下降、稳定性 降低。
[0008] 近几年，随着多种生物展示技术的发展，定制抗体库技术得到了一个跳跃式的进 步。因为定制抗体库方法具有以下优点：定制抗体库方法简单快速，避免了因杂交瘤的不 稳定而导致的反复亚克隆；通过定制人源基因框架，完全避免了人源化改造的难题；具有 外筛选功能，那些因机体免疫耐受机制而不能反应和增殖的针对自身抗原和毒性分子的抗 体，通过抗体库来进行研究和利用也成为了可能。随着分子生物学的发展，定制抗体库本身 的随机化和库容量大的特点也越来越完善，因此构建库容量相对较大，高亲和力抗体含量 相对较高的人源化抗体库将是各大药厂和研究者的追求目标。
[0009] 现在常用的定制抗体库技术，对于库容要求低，突变位点少的情况，利用简并合成 结合有效的筛选手段即可达到要求。但是此方法会引入无关突变或者终止密码子，造成需 要合成较长的序列时肽库质量明显下降，因此无法应用于突变位点多，或者简并位点涉及 的氨基酸种类较多的情况，更无法满足完全随机化的要求。一些改进的方案，例如（NNK) n、（NNB)n和（VNN)n方案，其中N=A、T、C或G;K=T或G;B=G、C或T;V=A、G或C， 在一定程度上增加了多样性并减少了终止密码子的参入，但因编码氨基酸的各种密码子在 各改进方案中出现的频率差异较大，在化学合成中各种亚磷酸酰胺单体在合成中会存在一 定的竞争活性差异，使得所合成序列的氨基酸组成偏向性难以控制，这种氨基酸组成偏向 性随目的序列的长度增加而更为明显。利用多核苷酸（双核苷酸或三核苷酸）代替单核苷 酸单体合成，特别是三核苷酸的合成方式则优点突出，它以三联体密码子为单位进行合成， 形成20种合成单元，利用这20种三联体合成单元的随机组合进行合成，就可以随意调控 特定位点参入氨基酸的种类和数量，从而避免了序列随机化以及无关氨基酸和终止密码子 的加入，但这种方法中使用的三联体原料非常昂贵，而且这种原料在化学合成中的耦合效 率很低，所以在实际操作中绝大多数实验室难以实现。
【发明内容】
[0010] 为解决上述技术问题，本发明提供了基于组合合成技术合成可控的人源化抗体 库的方法与应用，基于组合合成（permutation)技术合成人源化基因工程抗体文库，该技 术通过把组合合成数学模型应用于基因合成过程，解决了常规合成过程中偏向性严重的问 题；可以根据特定的需求随意的调整氨基酸的种类和数量，达到序列高度随机化、订制化的 需求，并且避免无关氨基酸和终止密码子加入，这些特点使其成为一种灵活性和可控性都 很高的蛋白文库合成方式。
[0011] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0012] 基于组合合成技术合成可控的人源化抗体库的方法，其包括以下步骤：
[0013] 第一步：设计人源化抗体库：在预构建的人源化抗体库中的合成序列中，在任意 位置或者任意比例引入氨基酸；
[0014] 第二步：组合合成随机引物库：在氨基酸变化区域，根据反向中心法则和DNA编码 规则，设计对应的DNA序列，通过DNA固相亚磷酰胺三酯法合成随机的引物库；
[0015] 第三步：构建人源化重组抗体库：在扩增体系中加入第二步中获得的引物库中的 引物，进行扩增，扩增产物进行酶切后连入载体，获得人源化重组抗体库；
[0016] 第二步中所述的组合合成随机引物库，包括以下几步：
[0017] (1)按照DNA固相亚磷酰胺三酯法，合成3'端的一段序列，直至产生氨基酸变化 位点；
[0018] (2)将⑴中合成的中间产物全部收集起来；
[0019] (3)根据设计的序列要求混合，按比例分组，从而达到变化数量的可控性；
[0020] (4)再继续合成相应的密码子碱基序列直至下一个氨基酸变化位点；
[0021] (5)根据氨基酸变化位点按照（2)-(4)中的收集、混合分组、合成方法完成所有氨 基酸变化位点；
[0022] (6)收集（5)中合成的中间产物后无需分组，直接合成5'端一段非氨基酸序列；
[0023] 根据设计的序列要求，按照所述（1)-(6)的方法完成待合成DNA序列和5'端全长 序列的合成。
[0024] 优选地，第一步所述的设计人源化抗体库，包括：
[0025] 合成人抗体重链可变区⑶R3的序列，构建⑶R3库在任意位置或者任意比例引 入氨基酸，引入氨基酸原则按照组合合成方式，将氨基酸平均分配或者根据需要的比例引 入；
[0026] 然后将所述氨基酸序列编码后开始合成；
[0027] 再根据已经公布的氨基酸在哺乳动物、大肠杆菌和酵母菌表达系统中密码子的偏 好性，选取密码子出现频率最高的作为编码位点。
[0028] 优选地，在哺乳动物、大肠杆菌、酵母