一种用于检测猪圆环病毒PCV1的Taqman Real-time PCR试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪圆环病毒检测技术领域，具体说是一种用于检测猪圆环PCV1病毒 的Taqman Real-timePCR试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Porcinecircovirus)属于圆环病毒科，圆环病毒属成员。猪圆环病 毒（PCV)为二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒。病毒粒子直径为17nm，是目前发现 的最小的动物病毒。根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV分为PCV-1和PCV-2。 PCV-1无致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现， 1982年证实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以 感染猪的常规病毒，不会对感染猪造成危害，但PCV1感染在世界各地都有报道，感染猪后 也能产生血清抗体，且可污染猪源细胞系。在流产与死亡的胎儿中被检出，提示其可垂直传 播。Saha等报道，PCV1感染能引起猪胚胎肺组织出现病理变化。Krakows等认为，PCV1与 猪细小病毒联合接种可引起仔猪结肠袢出现肉芽肿性淋巴结炎。可见，PCV可能具有潜在 致病性或影响疾病的发展，因此有必要加强对PCV1的调查及检测研究。
[0003]PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemic WaStingSyndr〇me，PMffS)，皮炎与肾病综合征（PNDS)的主要病原，PCV感染可引起猪的免疫 抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是圆环病毒与猪的许多疾病混合感染有关的原 因。最常见的混合感染有猪瘟、PRV(伪狂犬病毒）、PPV(细小病毒）、肺炎支原体、多杀性巴 氏杆菌、PEDV(流行性腹泻病毒）、SIV(猪流感病毒），有的呈二重感染或三重感染，其病猪 的病死率也将大大提高，有的可达25%~40%。PCV1的发现及今后对于该病毒的研究最终 取决于与PCV2表征的鉴别区分，伴随着PCV2出现的一些疾病症状及给养猪业带来的损失 已日趋严重，如何迅速发现并防控这一疾病在全球范围内的感染将是兽医、诊断专家和研 究者多学科跨领域间合作的一个重要议题。
[0004] 目前应用于PCV1的检测技术多为病毒分离、间接免疫荧光、免疫过氧化物单层培 养（IPMA)、ELISA(酶联免疫吸附实验），聚合酶链式反应（PCR)，核酸探针杂交及原位杂交 试验（ISH)等方法。但是大部分是针对PCV2的，关于PCV1的检测目前还是个空白，因此， 急需建立一种可以准确诊断PCV1和PCV2的敏感、特异、重复性好的检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服目前国内市面缺乏用于准确鉴别诊断PCV1与 PCV2的特异性检测的技术手段的难题，提供一种用于能够快速、敏感、准确以及低成本地检 测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法， 本试剂盒及其使用方法还适用于检测低微含量的猪圆环病毒PCV1。
[0006] 为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
[0007] -种用于检测猪圆环病毒PCV1的TaqmanReal-timePCR试剂盒，所述试剂盒包 含扩增预混液、阳性对照、无RNA酶水、序列SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的引物及SEQID N0:3的探针引物的混合物。
[0008] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:2的引物混合物包括：
[0009] SEQIDN0:1 :上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT
[0010] SEQIDN0:2 :下游引物GTTACAGATGGCGCCGAAAGACG
[0011] 探针引物序列为：
[0012] SEQIDN0:3：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG
[0013] 所述探针引物的5'端标记物为FAM报告荧光基团、3'端标记物为TAMRA淬灭荧光 基团。
[0014] SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延长的序列：
[0015] SEQIDN0:4(180bp)：
[0017] 所述阴性对照为无RNA酶水。
[0018] 所述阳性对照为含有猪圆环病毒PCV1基因序列的阳性质粒pGM-173,其构建方式 如下：
[0019] a.猪圆环病毒PCV1基因组RNA的提取按基因组DNA提取试剂盒说明书进行操 作。以提取的病毒DNA为模板，以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为引物扩增，反应条件为 94°C预变性5min;94°C变性50s，55. 5°C退火40s，72°C延伸50s，共30个循环；72°C再延伸 8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0020] b.PCR产物的克隆及序列分析
[0021] PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列 测定正确的质粒命名pGM-173,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为 356ng/ul，计算出其拷贝数为1. 13xlOn (copies/ul，拷贝数/微升），本发明的试剂盒利用 1. 13xl07(C〇pies/ul)浓度的质粒作为阳性对照以及利用其倍比稀释后作为标准曲线。
[0022] 所述试剂盒用于检测猪圆环病毒PCV1的使用方法，包括以下步骤：
[0023] 实时荧光定量RT-PCR，反应体系如下：
[0024] a.OneStepRT-PCRbuffer: 12. 5 份；
[0025] b.弓丨物浓度均为lOpmol/μ1的三条引物混合液3份，其中173bp上游引物1份， 173bp下游引物1份，探针引物1份；
[0026] c.酶混合物1份；
[0027]d.无RNA/DNA酶水 5. 5 份；
[0028] e.提取样品的RNA模板3份；
[0029] f.阳性对照pGM-173阳性质粒3份；
[0030] g.阴性对照无DNA酶水3份。
[0031] 实时荧光定量PCR，扩增条件如下：
[0032] 94°C预变性 2min;94°C20s，退火温度 55. 5°C30s，72°C20s，40 个循环。
[0033] 根据扩增结果，判定标准为：
[0034] 在NTC没有Ct值的情况下，Ct值〈35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复 检测。再次测定时该样品Ct值〈35为阳性，Ct值多35为阴性。也可以依扩增得到的Ct 值根据标准曲线对样品进行准确定量。
[0035] 本发明设计了特异性针对PCV1的引物及探针，旨在建立一种可以快速、灵敏、准 确地检测我国PCV1的荧光定量RT-PCR方法，优化并组装成试剂盒。该方法的建立对临床 诊断PCV1和流行病学调查具有重要意义。与普通RT-PCR方法相比，本发明省时、省力，成 本较低，对模板浓度要求较低，可用于检测低微含量的PCV1 ;无需电泳就可直观的反应检 测结果，避免了溴化乙锭对人体健康的危害。本发明在检测过程将常规PCR与荧光检测相 结合的技术，不仅具有敏感性高、特异性强等优点，而且使得检测时间由原来的4-5小时缩 短到现在的1-2小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了探针法，只有探针引物特异 的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，使本发明与普通PCR方法相比具有更高 的准确性。另外，荧光定量可以看到整个扩增过程、扩增效率、溶解温度，利用已知起始拷贝 数的标准品直接得到标准曲线，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数，进行精确定量。因此具有高度特异、敏感、简单、准确等特点。另外，可通 过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，有助于猪圆环病毒PCV1的防控和隐 性带毒动物的剔除，避免造成大范围的污染。本发明试剂盒及其使用方法适用于任何实验 室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等，具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明制作标准曲线。
[0037] 图2为本发明样本检测图。
[0038] 图1中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
[0040] 实施例1
[0041]1、引物的设计和制备
[0042] 参照GenBank(基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区 ±或，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
[0043] 扩增引物序列为：
[0044]SEQ ID N0:1 :上游引物GAAAGGTAGGGGTAGGGGGTTGGT
[0045]SEQ ID N0:2 :下游引物GTTACAGATGGCGCCGAAAGACG
[0046] 探针引物序列为：
[0047] SEQ ID NO: 3 ：CCGCCTGAGGGGGGGAGGAACTG
[0048] 上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
[0049] 阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并 保存。
[0050]2、制作阳性对照及其对应标准曲线
[0051] 阳性对照为含有猪圆环病毒PCV1基因序列的阳性质粒pGM-173,其构建方式如 下：
[0052] a.猪圆环病毒PCV1基因组RNA的提取按基因组DNA提取试剂盒说明书进行操 作。以提取的病毒DNA为模板，以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作为引物扩增，反应条件为 94°C预变性5min;94°C变性50s，55. 5°C退火40s，72°C延伸50s，共30个循环；72°C再延伸 8min，4°C5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
[0053] b.PCR产物的克隆及序列分析
[0054] PCR产物用TaKaRa公司的胶回收试剂盒回收，将回收产物与pGEM-TEasy载体连 接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板 上，37°C培养12~16h。经蓝白斑筛选后，用质粒（小量）提取试剂盒提取质粒，将序列测定 正确的质粒命名PGM-173,应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测定质粒浓度为356ng/ ul，并计算出拷贝数为1. 13xlOn (copies/ul，拷贝数/微升），将其10倍倍比稀释后按照 标准曲线制作程序制作标准曲线，依标准曲线将1. 13xl07(copies/ul)浓度的质粒作为阳 性对照。
[0055] 3、制备用于检测10头份的试剂盒
[0056] 本试剂盒由以下组分组成：
[0057] a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1 ；
[0058] b.引物浓度均为lOpmol/μΙ的三条引物混合液30μ1，其中173bp上游引物 10μ1，173bp下游引物10μ1，探针引物10μ1 ;