用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物分子病毒学领域，特别是涉及一种用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针以及试剂盒。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，给全球养猪业造成了巨大经济损失。PCV2感染可严重破坏易感动物的免疫系统，产生严重的免疫抑制，且易诱发多种细菌及病毒的协同感染或继发感染，给该病的防控带来巨大困难。1991年猪圆环病毒病首次发现于加拿大，之后迅速在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和非洲等国家流行，严重威胁生猪养殖业的可持续发展。我国自2001年首次分离到PCV2以来，山东、浙江、山西、广东、河南等省份先后报道该病发生，由PCV2引起的PWMS近年来在我国相关养猪地区呈现暴发流行趋势，对我国的生猪产业造成巨大经济损失。
[0003]当前国内外致力于PCV2在各器官中的定位和复制情况研究，但是电子显微镜和免疫荧光方法只能检测成熟病毒粒子，而无法定位病毒ssDNA，而且检测灵敏性低无法实现精确定量;Realtime RT-PCR方法能对PCV2 ssDNA总量进行检测但无法在细胞或亚细胞水平上进行PCV2 ssDNA定位。
[0004]因此，上述方法均未能有效获得PCV2 ssDNA复制和增殖变化的详细动态过程。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针以及试剂盒，具有高敏感性和稳定性的特点，克服了传统荧光原位杂交法信号基团强度低，检测灵敏度差的技术问题。
[0006]基于上述目的，本发明提供的用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针包括5条针对猪圆环病毒2型的特异性探针序列:
[0007] P1:5，-TGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAAC-3，；
[0008]P2:5 ’-GTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAG-3 ’；
[0009]P3:5 ’-CTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGA-3 ’；
[0010] P4:5，-CACGGATATTGTAGTCCTGGTCGTTATTTACTGTTTTCGAA-3，；和
[0011]P5:5 ’-AGTCGTCAAGATTAAATCTCAGCATGTCCA-3 ’。
[0012]在本发明的一些实施例中，所述5条针对猪圆环病毒2型的特异性探针都标记红色荧光基团。
[0013] 在本发明的一些实施例中，所述红色荧光基团选自Cy3基团、R0X基团、Texas Red基团和LC RED640基团中的至少一种。
[0014]在本发明的一些实施例中，还包括2条针对猪内参基因β-actin的特异性探针序列:
[0015] P1:5，-TCCTTCCTGGGTATGGAATCCTGT-3，；和
[0016]P2:5 ’-GCATCCACGAAACTACCTTCAACTCAATCATGAA-3 ’。
[0〇17]在本发明的一些实施例中，所述2条针对猪内参基因β-actin的特异性探针标记绿色荧光基团。
[0018]在本发明的一些实施例中，所述绿色荧光基团选自FAM基团或者FITC基团。
[0〇19] 在本发明的一些实施例中，所述探针基于QuantiGene ViewRNA技术，用于检测和/或定位PCV2 ssDNA。
[0020]本发明还提供一种试剂盒，包括上述用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针。
[0021]从上面所述可以看出，本发明提供的用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针以及试剂盒可用于对猪圆环病毒2型进行检测和定位，尤其适用于基于QuantiGene ViewRNA原位杂交技术的检测。本发明基于QuantiGene ViewRNA技术的新型PCV2 ssDNA原位杂交检测技术，能够特异、敏感、快速、简便地从培养细胞、组织和临床样本中对目标ssDNA进行检测和定位，可以清晰地可视化检测和定位PCV2 ssDNA，从而在核酸水平上对PCV2感染过程中病毒ssDNA的复制、增殖规律进行阐述，同时对明确PCV2富集样品的临床采集提出指导意见。
【附图说明】
[0022]图1为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测建立的结果图，其中红色亮点为PCV2 ssDNA染色结果;绿色亮点为β-actin染色结果;蓝色亮区为细胞核染色结果；
[〇〇23]图2为采用本发明实施例的探针进行原位杂交检测BVDV、PRV、CSFV以及PCV2的特异性的结果图；
[〇〇24] 图3为使用PCV2 QuantiGene ViewRNA原位杂交检测法和PCV2单抗免疫荧光法进行检测的结果图；
[0025]图4为采用本发明实施例的探针进行多次重复原位杂交检测建立的结果图。
【具体实施方式】
[0026]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
[〇〇27] 近年来，QuantiGene ViewRNA技术在重大人类疾病如癌症和艾滋病研究中均有应用，对这些疾病致病机理的研究提供了可靠的佐证，但在兽医病原微生物的检测方面鲜有报道，本发明是首次将该技术应用在猪圆环病毒2型的检测和定位中。作为本发明的一个实施例，本发明提供的用于检测和定位猪圆环病毒2型的探针包括5条针对猪圆环病毒2型的特异性探针序列:
[0028]P1:5 ’-TGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAAC-3 ’；
[0029] P2:5 ’-GTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAG-3 ’；
[0030] P3:5 ’-CTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGA-3 ’；
[0031] P4:5，-CACGGATATTGTAGTCCTGGTCGTTATTTACTGTTTTCGAA-3，；和
[0032] P5:5 ’-AGTCGTCAAGATTAAATCTCAGCATGTCCA-3 ’。
[0033] 该套探针可用于对猪圆环病毒2型进行检测和定位，尤其适用于基于QuantiGeneViewRNA原位杂交技术的检测。
[0034]作为本发明的一个实施例，采用本发明的探针进行检测和定位猪圆环病毒2型的步骤如下:
[0035]一、材料:
[0036]猪圆环病毒2型(DBN-SX07株)；PK15传代细胞系。
[〇〇37]本发明所采用的PCV2培养细胞为ΡΚ15细胞系，用TCID5Q为1(Γ5.5/100μ?的猪圆环病毒2型DBN-SX07株接种ΡΚ15细胞，放于37°C温箱孵育72h。
[0038]二、试剂:
[0039]QuantiGene ViewRNA ISH Cell Assay购自美国Affymetrix公司；八孔玻璃细胞培养板(Lab-Tek II Chamber Slide)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
[0040]三、步骤:
[0041]1、设计并合成猪圆环病毒2型特异性探针和猪内参基因β-actin的特异性探针
[〇〇42]对GenBank公布的猪圆环病毒2型(PCV2)全序列利用Oligo 7.0软件设计5条特异性的PCV2探针，采用BLAST工具进行检索，验证以上序列的特异性。这5条针对猪圆环病毒2型的特异性探针序列如下:
[0043]P1:5 ’-TGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAAC-3 ’；
[0044]P2:5 ’-GTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAG-3 ’；
[0045]P3:5 ’-CTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGA-3 ’；
[0046]P4:5，-CACGGATATTGTAGTCCTGGTCGTTATTTACTGTTTTCGAA-3，；和
[0047]P5:5 ’-AGTCGTCAAGATTAAATCTCAGCATGTCCA-3 ’。
[0048]并对5条特异性探针均标记红色荧光基团。可选地，所述红色荧光基团选自Cy3基团、R0X基团、Texas Red基团和LC RED640基团中的至少一种。
[0049]对GenBank公布的猪看家基因0-actin(ACTB)序列(AK237086)设计特异性探针作为内参，所述猪内参基因β-actin的特异性探针序列如下:
[0050]P1:5 ’-TCCTTCCTGGGTATGGAATCCTGT-3 ’；和
[0051 ] P2:5 ’-GCATCCACGAAACTACCTTCAACTCAATCATGAA-3 ’。
[〇〇52]并对2条特异性探针标记绿色荧光基团。可选地，所述绿色荧光基团选自FAM基团或者FITC基团。
[〇〇53]2、传代细胞的准备
[〇〇54]将长满单层的PK-15细胞，用胰酶消化分散，利用血清浓度为10%的MEM细胞生长液终止消化，按照1:1传代比例获得传代细胞悬液，将细胞铺8孔玻璃细胞培养板，每孔120μ
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[0055]3、猪圆环病毒2型种毒的接种
[〇〇56]待8孔玻璃细胞培养板中培养的H(15细胞长成70-80%时，接种猪圆环病毒2型DBN-SX07 株(TCIDso 为 10—5'5/100yL)120yL，放于 37°C 温箱孵育 72h