幽门螺杆菌定性和定量多重基因检测体系及其试剂盒和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多重基因检测产品以及该产品所用到的检测体系，属于生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 幽门螺杆菌(H.pylori)是一种革兰阴性、微需氧、弯曲状杆菌，主要寄居在人体胃 部。幽门螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等 发生发展密切相关，因此引起临床的广泛关注。1994年，国际癌症研究机构IARC已将其列为 人类I类致癌因子，是目前为止唯一被列为明确对人类致癌的细菌性病原微生物。很多报告 认为幽门螺杆菌感染与冠心病、类风湿、肝胆病、肺结核、妊娠呕吐、直结肠癌及多种皮肤病 等疾病有关。流行病学显示，全球几乎有一半的人口感染此菌，发展中国家甚至高达60%~ 70%。因此，幽门螺杆菌感染是世界各国需要面对的公共卫生问题。
[0003] 幽门螺杆菌致病性与其感染量密切相关。目前幽门螺杆菌检测和鉴定方法均有其 局限性。例如：1)分离培养鉴定:幽门螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺杆 菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，因此检出率极低，作为常规诊断手段不易推 广，且幽门螺杆菌培养需要一定的时间，不利于快速诊断。2)组织病理切片染色法:该方 法是把患者胃镜检查活检组织切片，染色后可观察到组织中的幽门螺杆菌。该方法受幽门 螺杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。3)尿素酶依赖性试验 (尿素呼气试验）：根据标志物不同分为 13C呼吸试验及14C呼吸试验，临床应用广泛。缺点是 费用高、易受抑菌药物和抑酸药物的影响、敏感度低。4)免疫学检查:检测血清中或唾液和 尿液中抗体(IgG)或直接检测粪便中幽门螺杆菌的抗原成分。其缺点是不能反映现症感染。 5)核酸分析法:包括测序、PCR、寡核苷酸探针杂交等，但是这些检查方法检测位点少，特异 性低，通量小，成本较高，且不能做定量分析。6)定量分析：常用的定量分析方法是real-time PCR， 但该方法检测单一，通量小，对多个基因分析时成本高。
[0004] 综上所述，如何快速、准确、全面地对幽门螺杆菌进行鉴定和定量分析是本领域的 技术人员迫切亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速、准确、低成本的幽门螺杆菌定性 和定量多重基因检测体系及其试剂盒，以及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应用。
[0006] 本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:一种幽门螺杆菌定性和定量 多重基因检测体系，可在同一个反应体系中进行其菌种鉴定、定量、毒力和耐药性分析。包 括对菌种鉴定基因 16S rRNA进行检测的引物，分别对毒力基因 cagA、vacA-sl、vacA-s2、 ￥&0厶111、￥30厶112、；[06厶1、；^6厶2、(1卯厶、€^厶和11^3进行检测的引物，分别对耐药基因233 rRNA的2143位点、rdxA的148位点、pbplA的1777位点和gyrA的261位点的进行多态性检测的 引物，以及分别对幽门螺杆菌的拷贝数进行定量分析的基因 ureC和β-globin进行检测的引 物;所述各引物的正向引物的5'端均设有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5' 端均设有反向通用引物序列。所述检测体系进行PCR反应后进行毛细管电泳分析。
[0007] 针对16S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，针对16S rRNA 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 针对cagA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，针对cagA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 针对vacA-sl或vacA-s2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，针对vacA- sl或VacA-s2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示； 针对vacA-ml基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.7所示，针对￥&〇六-!111基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示； 针对vacA-m2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.9所示，针对￥&〇六-!112基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 针对iceAl基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，针对iceAl基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示； 针对iceA2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，针对iceA2基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示； 针对dupA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示，针对dupA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 针对oipA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示，针对oipA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 针对luxS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示，针对luxS基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示； 针对23S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，对应23S rRNA基因 2143位点为碱基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，对应23S rRNA基因2143 位点为碱基G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 针对rdxA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，对应rdxA基因148位点 为碱基C的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，对应rdxA基因148位点为碱基T的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 26所示； 针对pbplA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，对应pbplA基因1777位 点为碱基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 28所示，对应pbplA基因1777位点为碱基 G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示； 针对gyrA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示，对应gyrA基因261位点 为碱基C或T的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 31所示，对应gyrA基因261位点为碱基G 或A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 32所示； 针对ureC基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，针对ureC基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示； 针对β-globin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.35所示，以及针对6-81〇1^11 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 36所示； 所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示； 所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0008] 针对16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、dupA、oipA 和luxS基因的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM;针对16S rRNA、ureC、cagA、 vacA-sl、vacA_ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、oipA、luxS、和β-globin基因的反向引物在检测 体系中的终浓度均为ΙΟΟηΜ;针对dupA和β-globin基因的正向引物在检测体系中的终浓度 均为ΙΟΟηΜ; 针对23S rRNA基因的2143位点、rdxA基因的148位点、pbp 1A基因的1777位点和gyrA基 因的261位点的正向引物在检测体系中的终浓度均为1 OOnM;对应23S rRNA基因2143位点为 碱基A的反向引物在检测体系中的终浓度均为300nM;对应23S rRNA基因2143位点为碱基G 的反向引物在检测体系中的终浓度均为350nM;对应rdxA基因148位点为碱基C、对应pbplA 基因1777位点为碱基A、对应gyrA基因261位点为碱基C或T的反向引物、对应rdxA基因148位 点为碱基T、对应pbplA基因1777位点为碱基G的反向引物在检测体系中的终浓度均为 400nM;对应gyrA基因261位点为碱基G或A的反向引物在检测体系中的终浓度均为450nM。
[0009] 上述幽门螺杆菌检测体系还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合 酶、带荧光的通用标签混合物和DNA模板;所述带荧光的通用标签混合物中包括反向通用引 物和带有荧光标记的正向通用引物。
[0010] 上述荧光标记为CY5、CY3或FAM等。
[0011] 上述幽门螺杆菌检测体系还包括阳性对照液和阴性对照液;所述阳性对照物是包 括所有目的基因靶点的质粒混合物;所述阴性对照液是无核酸酶超纯水。
[0012] 上述幽门螺杆菌检测体系反应时体系中的组分用量为10 X的PCR缓冲液1体积，带 荧光的通用标签混合物和2mmol/L的dNTPs共1体积，25mmol/L的MgCl2溶液2体积，引物混合 物1体积，5U/yL的热启动DNA聚合酶1体积，DNA模板2体积，纯水2体积。
[0013] 上述DNA模板的使用量为5~50ng/体系。
[0014] 本发明为解决上述技术问题