一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其包括：1、以4周龄雌性C57BL/6小鼠为试验动物，用混合抗生素灌胃3～7天；所述的混合抗生素为庆大霉素、万古霉素和制霉菌素；2、将步骤1灌胃后的C57BL/6小鼠饲养6～8天；3、接种幽门螺杆菌：将步骤2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽门螺杆菌菌液灌胃，8～12小时后进食；所述的步骤3的接种频率为：隔日1次，共2～4次；4、将经步骤3，2～4次接种后的小鼠进行饲养。本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染幽门螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于相关研究的幽门螺杆菌感染动物的方法。
【专利说明】一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物学和实验动物学领域，特别涉及一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)被公认为是胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要致病因子，人是幽门螺杆菌感染的唯一易感宿主。在发达国家，幽门螺杆菌感染率约为50%左右，而在发展中国家则达到60%以上。为此，国内外研究者正在通过建立幽门螺杆菌感染的动物模型，研究幽门螺杆菌致病机理、特异性防治以及一些药物或微生态制剂的疗效。
[0003]国内外关于幽门螺杆菌感染动物模型的报道中，以豚鼠、裸鼠作为实验动物的，由于易死亡、自身的免疫缺陷等问题，使得建模成功率低于80%，且模型应用受到一定局限；以小鼠CD1、Balb/c A以及Balb/c等品种作为实验动物的，则感染率不高，且模型不稳定。其他以猴子、沙鼠、小猪等动物为模型的，存在价格昂贵、数量少、饲养条件高、感染困难等限制因素。同时，所有报道中的建模实验时间较长，连续灌胃且次数较多，大大增加了建模时动物的死亡率和并发症的产生。因此，对于幽门螺杆菌机理、药物应用等研究，一个稳定的、重现性好的动物模型进行临床前的动物实验是必要的，找到一种普通的、易于饲养的动物，建立一个建模时间短、操作次数少、感染幽门螺杆菌数量级高、建模致死率低的动物模型建立方法，为幽门螺杆菌感染的彻底攻克奠定了基础。`
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中建立幽门螺杆菌感染的动物模型可控性差、不稳定，成功率不高，建模时间较长，操作复杂，成本较高，一般实验室中难于建立等缺陷，而提供了一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法。本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染幽门螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于相关研究的幽门螺杆菌感染动物的方法。
[0005]本发明通过下述技术方案解决上述技术问题:
[0006]本发明提供了一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其包括以下步骤:
[0007]步骤1、以4周龄雌性C57BL/6小鼠为试验动物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素为庆大霉素、万古霉素和制霉囷素；
[0008]步骤2、将步骤I灌胃后的C57BL/6小鼠饲养6-8天；
[0009]步骤3、接种幽门螺杆菌:将步骤2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽门螺杆菌菌液灌胃，8-12小时后进食；
[0010]所述的步骤3的接种频率为:隔日I次，共2-4次；
[0011]步骤4、将经步骤3，2-4次接种后的小鼠进行饲养。
[0012]步骤I中，用混合抗生素灌胃可以有效降低小鼠胃部原有菌群对幽门螺杆菌感染建立的影响。所述的灌胃的方法可参考本领域中常规的灌胃方法进行。所述的用混合抗生素灌胃的天数优选7天。
[0013]步骤I中，所述的4周龄雌性C57BL/6小鼠可为本领域常规的4周龄雌性C57BL/6小鼠，一般体重都在llg± I-2g。
[0014]步骤I中，所述的混合抗生素中，较佳地，庆大霉素0.058-0.062万单位/只/天，万古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77万单位/只/天；更佳地，庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77万单位/只/天。
[0015]步骤2中，所述的饲养可为本领域中常规的饲养方法，一般在SPF级环境中饲养。所述的 SPF (specific-pathogen-free)级环境为:温度 22±2°C,,湿度 56±5%，I 周换 2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。
[0016]步骤2中，所述的饲养的时间优选为7天。
[0017]步骤3中，所述的禁食的时间优选12-24h，更优选24h。
[0018]步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液为将幽门螺杆菌菌体悬于其液体培养基中形成的菌液；所述的幽门螺杆菌菌液中，所述的液体培养基可为BHI (brain heart infusion)。
[0019]步骤3中，所述的幽门螺杆菌优选为幽门螺杆菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydneystrain SSI, Hp SSlX
[0020]步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液中，其细菌密度优选大于IX 108cfu/mL，更优选为 lX109cfu/mL。
[0021]步骤3中，所述的灌胃的方法可为本领域常规的灌胃方法。所述的灌胃的次数优选3次。
[0022]步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液灌胃量优选0.18-0.22mL/只/次，更优选
0.2mL/ 只 / 次。
[0023]步骤3中，所述的接种频率优选为:隔日I次，共3次。
[0024]步骤4中，所述的饲养的方法可为本领域常规的饲养方法，一般在SPF级环境中饲养。所述的 SPF (specific-pathogen-free)级环境为:温度 22±2°C,,湿度 56±5%，I 周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。所述的饲养的时间优选为两周。
[0025]所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法后，还可通过抽检确定步骤来确定是否将幽门螺杆菌定殖于胃部。
[0026]所述的抽检确定步骤优选包括:将经过上述步骤I-步骤4处理的C57BL/6小鼠禁食24h后处死，取幽门端，通过尿素酶实验、细菌培养和病理切片验证幽门螺杆菌是否定殖于胃部。所述的抽检确定步骤可参考文献:“建立幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠动物模型”，《使用临床医药杂志》，2013年第17卷第I期，P27-P33。
[0027]本发明中，小鼠进食的饲料可为本领域中常规的饲养饲料。
[0028]在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0029]本发明中除所述的幽门螺杆菌菌株外，所用试剂和原料均市售可得。
[0030]本发明的积极进步效果在于:本发明的建模方法实验时间短、操作次数少、感染幽门螺杆菌数量级高、感染时间长久，模型能广泛应用于各项幽门螺杆菌相关研究。【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为阴性对照小鼠胃组织切片。
[0032]图2为阳性对照小鼠胃组织切片。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0034]下述实施例中涉及的饲养均是在SPF级环境下进行饲养，具体条件为:温度22±2°C，，湿度56±5%，I周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。
[0035]庆大霉素、万古霉素、制霉菌素:上海闪晶生物公司。
[0036]幽门螺杆菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI):仁济医院惠赠。所述的幽门螺杆菌悉尼菌株SSl在以下文献中被报道:“幽门螺杆菌(SSl)感染及其胃炎的小鼠模型”，《中国微生态杂志》，2003年6月第15卷第3期。
[0037]BHI 培养基:0xoid 公司。
[0038]实施例1:
[0039]4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉`素1.7mg/只/天，制霉菌素0.77万单位/只/天)—正常饲养一周一接种幽门螺杆菌:小鼠禁食24h后，0.18mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度lX109cfu/mL，8小时后进食。隔日I次，共3次一饲养两周一抽检确定。建模抽检的接种成功率100%，建模成活率96%。
[0040]实施例2:
[0041 ] 4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃7天(方案--庆大霉素0.058万单位/只/天，万古霉素1.2mg/只/天，制霉菌素0.72万单位/只/天)—正常饲养6天一接种幽门螺杆菌:小鼠禁食24h后，0.2mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度lX109cfu/mL，8小时后进食。隔日I次，共3次一饲养两周一抽检确定。建模抽检的接种成功率100%，建模成活率100%。
[0042]实施例3:
[0043]4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重Ilg± I-2g，混合抗生素灌胃3天(方案--庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.5mg/只/天，制霉菌素0.77万单位/只/天)—正常饲养6天一接种幽门螺杆菌:小鼠禁食24h后，0.22mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度lX109cfu/mL，12小时后进食。隔日I次，共2次一饲养两周一抽检确定。建模抽检的接种成功率100%，建模成活率100%。
[0044]实施例4:
[0045]4周龄雌性C57BL/6小鼠，48只，体重llg±l-2g，混合抗生素灌胃7天(方案:庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7g/只/天，制霉菌素0.77万单位/只/天)—正常饲养8天一接种幽门螺杆菌:小鼠禁食12h后，0.22mL/只/次的幽门螺杆菌菌液灌胃，细菌密度lX108cfu/mL，12小时后进食。隔日I次，共4次一饲养两周一抽检确定。建模抽检的接种成功率100%，建模成活率94%。
[0046]效果实施例1
[0047]1、建模评估
[0048]I)尿素酶实验:取小鼠近幽门端1/3的胃，立即置于尿素酶快速检测卡(珠海丽珠试剂有限公司)中，24h后观察。
[0049]结论:抽检小鼠尿素酶反应均为阳性。
[0050]2)细菌培养:将实施例1的小鼠胃组织幽门端的1/3与400 ii L BHI置于无菌的玻璃匀浆器内匀浆数次，分别取匀浆液的10倍和100倍的无菌生理盐水(浓度0.75%，氯化钠相对于溶液的质量百分数，经灭菌处理的生理盐水)稀释液各IOOii L (样本1、样本I1、样本III)涂板，培养后镜检菌落并进行菌落计数，结果如表I所示。
[0051 ] 表I建模抽检幽门螺杆菌菌落计数结果
[0052]
【权利要求】
1.一种幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其包括以下步骤:步骤1、以4周龄雌性C57BL/6小鼠为试验动物，用混合抗生素灌胃3-7天；所述的混合抗生素为庆大霉素、万古霉素和制霉囷素；步骤2、将步骤I灌胃后的C57BL/6小鼠饲养6-8天；步骤3、接种幽门螺杆菌:将步骤2得到的C57BL/6小鼠禁食，用幽门螺杆菌菌液灌胃，8-12小时后进食；所述的步骤3的接种频率为:隔日I次，共2-4次；步骤4、将经步骤3，2-4次接种后的小鼠进行饲养。
2.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤I中，所述的混合抗生素中，庆大霉素0.058-0.062万单位/只/天，万古霉素1.2-1.7mg/只/天，制霉菌素0.72-0.77万单位/只/天。
3.如权利要求2所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤I中，所述的混合抗生素中，庆大霉素0.062万单位/只/天，万古霉素1.7mg/只/天，制霉菌素：0.77万单位/只/天。
4.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的禁食时间为12-24小时。
5.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的幽门螺杆菌为幽门螺杆菌悉尼菌株SSl (H.pylori Sydney strain SSI, Hp SSI)。
6.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液为将幽门螺杆菌菌体悬于其液体培养基中形成的菌液；所述的幽门螺杆菌菌液中，所述的液体培养基为BHI。
7.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液中，其细菌密度大于1*108cfu/ml，优选1*109cfu/ml。
8.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤3中，所述的幽门螺杆菌菌液灌胃量为0.18-0.22mL/只/次，优选0.2mL/只/次。
9.如权利要求1所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:步骤4中，所述的饲养的时间为两周。
10.如权利要求1或9所述的幽门螺杆菌感染动物模型的建立方法，其特征在于:所述的饲养在SPF级环境中饲养；所述的SPF级环境为:温度22±2°C，，湿度56±5%，I周换2-3次垫料，控制12h光照，12h黑暗；饲料:常规饲料；自由进食、进水。
【文档编号】A61K31/7048GK103446576SQ201310415511
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】苗君莅, 郭本恒, 刘振民, 吴正钧, 于鹏 申请人:光明乳业股份有限公司