一种肺纤维化动物模型的建立的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及实验动物学领域，特别涉及利用血管紧张素II建立肺纤维化动物模型 的方法。
【背景技术】
[0002] 肺纤维化是一种进行性致死性疾病，发病率逐年增加，死亡率相当高，平均生存时 间2-2. 5年。目前其发病机制尚不清楚，无有效的治疗方法。因此，建立一种简便、成熟而 稳定的符合肺纤维化发病过程的动物模型，对深入研究肺纤维化发病机制、开发先进的治 疗方法具有极其重要的意义。
[0003]肺纤维化动物模型是研究疾病发生发展和新型药物必不可少的实验手段。在严格 控制各种条件下，利用动物模型，我们可以观察肺纤维化的发生、发展和疾病转归以及这些 不同改变在形态学、影像学和分子生物学上的表现等规律。目前肺纤维化模型有很多种，其 中以博莱霉素（BLM)诱导的肺纤维化模型使用最多。BLM是具有抗肿瘤作用的多组分复合 抗生素，其毒副作用之一是引起肺纤维化，由于病理组织学改变与人类肺纤维化最为接近， 故被广泛用于诱导肺纤维化模型。利用BLM进行模型制备的途径包括气管给药，经鼻给药， 静脉注射，腹腔注射等，其中经气管给药已是国内外公认的成熟方法。但是用BLM诱导的动 物肺纤维化模型来推导人类肺纤维化，或者是研究BLM对人类肺的毒性，都有一定的局限 性，主要体现在：（1)与人类特发性肺纤维化（IPF)-般病程相比，气管给药BLM诱导的动物 肺纤维化模型可以自然消散；（2)糖皮质激素类药物对人类和动物的BLM诱导的肺纤维化 十分有效，而对人类IPF作用却有限；（3)动物肺纤维化模型中BLM诱导的气管给药和人类 的全身静脉用药相比，前者会改变肺纤维化的动力学进程；（4)人类IPF的病理过程最初起 源于肺泡上皮细胞，而BLM诱发的肺纤维化早期病变可能是由肺泡内皮细胞的损伤而致。
[0004]此外不同给药方式也会造成模型病理的不同，气管给药方法有给药次数少、操作 较难、动物死亡率高、急性肺损伤程度重、胶原代谢紊乱的程度轻、纤维化病灶的分布以支 气管周围为显著的特点；腹腔或皮下给药方法有给药次数多、操作较容易、动物死亡率低、 急性肺损伤程度较轻、胶原代谢紊乱的程度较重、纤维化灶的分布以胸膜下为显著的特点， 此点可能更近似于人类的普通型肺纤维化（UIP)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服BLM多组分共同作用、操作较难、动物死亡率高的缺点， 而提供一种操作方法简单，对模型动物损伤较小，模型成功率高，且非常符合肺纤维化发病 过程的肺纤维化动物模型。
[0006]血管紧张素II在制备肺纤维化动物模型中的应用。
[0007] -种肺纤维化动物模型的制备方法，它包括：将7-9周龄FVB小鼠，按体重 0. 4-0. 6mg/kg，隔日皮下注射血管紧张素II，连续注射50-70天； 所述的注射剂量为按体重〇. 5mg/kg; 所述的连续注射时间为60天。
[0008] 本发明提供了一种新型肺纤维化模型，它是应用介导肺纤维化发生的重要启动因 子作为诱导剂，采用血管紧张素II〇. 5mg/kg体重，隔日皮下注射2个月，成功诱导肺组织纤 维化，且操作方法简单，对模型动物损伤较小，模型成功率高，建立时间比较符合肺纤维化 慢性进展的特征，模型成型后比较稳定，克服了博来霉素造模28天后可能出现的自愈情况 或早期死亡。这将对今后研究肺纤维化发病机制和靶向治疗药物提供良好的模型基础，尤 其对今后在分子水平乃至基因水平层面研究肺纤维化发病机制将是个重大突破。
【附图说明】
[0009]图1肺组织HE染色状态图（X40,a:对照组，b:模型组）； 图2肺组织苦味酸天狼猩红染色状态图（X40,a:对照组，b:模型组）； 图3对照组和模型组CTGF蛋白表达对比图； 图4对照组和模型组PAI-1蛋白表达对比图； 图5对照组和模型组TNF-alpha蛋白表达对比图。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1造模 本发明通过对FVB小鼠皮下注射血管紧张素II，诱导小鼠肺组织纤维化。具体造模流 程及检测方法如下： (1) 动物分组：将8周龄雄性FVB小鼠随机分为2组，即对照组和模型组，每组30只； (2) 血管紧张素II造模：模型组隔日皮下注射非压力剂量AngII0.5mg/kg体重（溶于 0. 5ml生理盐水)，对照组皮下注射等容积生理盐水。分别观察15天、30天、60天后处死小 鼠，观察肺组织变化； (3) 饲养条件：可为本领域中常规的饲养方法，一般在SPF级环境中饲养。所述的SPF (specific-pathogen-free)级环境为：温度 22±2°C，，湿度 56±5%，1 周换 2-3 次垫料，控 制12h光照，12h黑暗；饲料：常规饲料；自由进食、进水。
[0011] (4)动物处死及标本制备：采用颈椎脱白法处死小鼠，开胸取肺组织，左肺置于福 尔马林液中浸泡，行肺组织病理学检测，右肺提取总蛋白质及mRNA行Westernblotting检 测及PCR检测。
[0012] 实施例2检测 对FVB小鼠进行肺纤维化程度测定，包括肺组织病理、肺细胞凋亡、炎症反应、纤维化 和氧化应激相关指标的测定。
[0013] (1)肺组织病理：取肺组织行石蜡包埋、脱水、切片后行HE染色，观察肺组织基本 结构改变，采用Szapiel的方法观察肺组织肺泡炎及肺纤维化程度，苦味酸天狼星红染色 (Sirius-Redstaining)观察肺组织I型-IV型胶原的表达。
[0014] (2)肺组织凋亡情况：Westernblotting检测Caspase3蛋白表达水平；肺组织病 理切片米用凋亡检测试剂盒Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP nickendlabelling(TUNEL)染色观察凋亡细胞。
[0015] (3)肺组织炎症反应：real-timePCR检测肺组织TNF-α和PAI-1mRNA表达水 平。
[0016] (4)肺纤维化和氧化应激产物测定：Westernblotting检测肺组织FN、CTGF、 p47phox和3-NT蛋白表达水平。
[0017] 实施例3造模结果评定 (1) 造模成功率：模型组30只小鼠，造模后2个月时形成肺纤维化共有29只，死亡1只 (测血压时不慎死亡)，造模成功率97% ; (2) 肺组织病理学改变：FVB小鼠被输注了 2个月的亚作用剂量（0. 5mg/kg)的血管 紧张素II后引起了肺脏的病理改变显著，可引起肺组织发生明显的炎症及纤维化反应（图 1)，苦味酸天狼猩红染色法显示的胶原纤维增多（图2); (3) 分子生物学检测结果：CTGF蛋白表达增高（图3)及PAI-1的表达增高（图4)可证 实肺纤维化；通过PAI-1和TNF-alpha水平的增加（图5)可以检测肺脏的炎症反应明显高 于对照组，以上检测结果均有统计学意义（P〈〇. 05); (4) 应用Angll2个月后，并未引起小鼠血压、心率的改变(见表1); 表1模型组和对照组的血压和心率
对照组和模型组小鼠的血压和心率没有明显差别（P均>0. 05)。
[0018] (5 )小鼠的心脏和肾脏组织中除了有少量炎性细胞外，未见到明显纤维化表现。
[0019] 本发明中，小鼠进食的饲料可为本领域中常规的饲养饲料，所用试剂和原料均市 售可得。
[0020] 本发明中，通过实验结果得出肺纤维化形成最佳时间为2个月。
【主权项】
1. 血管紧张素II在制备肺纤维化动物模型中的应用。2. -种肺纤维化动物模型的制备方法，它包括：将7-9周龄小鼠，按体重0. 4-0. 6mg/ kg，隔日皮下注射血管紧张素II，连续注射50-70天。3. 根据权利要求2所述的一种肺纤维化动物模型的制备方法，其特征在于：按体重 0·5mg/kg〇4. 根据权利要求2或3所述的一种肺纤维化动物模型的制备方法，其特征在于：连续 注射60天。5. 根据权利要求4所述的一种肺纤维化动物模型的制备方法，其特征在于：所述的小 鼠为8周龄FVB小鼠。
【专利摘要】本发明公开了一种新型肺纤维化模型，它是应用介导肺纤维化发生的重要启动因子作为诱导剂，采用血管紧张素Ⅱ0.5mg/kg体重，隔日皮下注射2个月，成功诱导肺组织纤维化，且操作方法简单，对模型动物损伤较小，模型成功率高，建立时间比较符合肺纤维化慢性进展的特征，模型成型后比较稳定，克服了博来霉素造模28天后可能出现的自愈情况或早期死亡。这将对今后研究肺纤维化发病机制和靶向治疗药物提供良好的模型基础，尤其对今后在分子水平乃至基因水平层面研究肺纤维化发病机制将是个重大突破。
【IPC分类】A61K38/08, A01K67/02
【公开号】CN105311618
【申请号】CN201510829662
【发明人】杨俊玲, 任锦, 赵凤莲, 张庆华, 郭志敏
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月25日