专利名称：肺纤维化处置剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及以肺的细胞外基质产生细胞为靶的物质递送用载体(carrier)以及 利用了该载体的肺纤维化处置剂和肺纤维化的处置方法。
背景技术：
肺纤维化是以肺泡壁上的弥漫性纤维增殖为特征、以干咳或劳作时的呼吸困难 为主要症状的疾病。狭义上是指间质性肺炎的晚期病态，广义上是指狭义的肺纤维化和 间质性肺炎的并存状态。所有的间质性肺炎可成为肺纤维化的原因。间质性肺炎是在肺 的间质(狭义上是指肺泡隔壁、广义上包括小叶间质、胸膜附近等)处产生炎症的疾病的 总称，包括感染、胶原病、放射线、药剂、粉尘等特定原因所导致的间质性肺炎和原因不明 的特发性间质性肺炎。特发性间质性肺炎根据胸腔镜下的肺活检(VATS)或高分辨电子 计算机断层照片(HRCT)所见等进一步分类为特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis :IPF)、非特异性间质性肺炎(nonspecific interstitial pneumonia :NSIP)、急 性间质性肺炎(acute interstitial pneumonia :AIP)、隐源性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia :C0P)、呼吸性细支气管炎相关性间质性肺病(respiratory bronchiolitis-associated interstitial lung disease RB-1LD)、月兌屑性间质性月市 炎(desquamative interstitial pneumonia :DIP)、淋巴细胞性间质性肺炎(lymphoid interstitial pneumonia :LIP)等。原因可确定的间质性肺炎多可通过除去其原因或投予 类固醇剂等抗炎剂等治愈，但对于特发性间质性肺炎来说，目前还不存在根治方法，仅是在 症状恶化时投予类固醇剂或硫唑嘌呤、环磷酰胺等或者在低氧血症发病时实施氧疗等的程 度，多会发展到肺纤维化而死亡。因此，诊断确定后的平均存活期限较短，为2. 5 5年，在 曰本被指定为特定疾病。面对这种状况，在肺纤维化治疗剂的开发中投入了大量的研究努力。结果，报道 了例如秋水仙碱、D-青霉胺、吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-[1Η]_吡啶酮)、干扰素β la、 松弛素、洛伐他汀、贝拉康坦、N-乙酰半胱胺酸、角化细胞生长因子、卡托普利(非专利文献 1)、肝细胞生长因子(专利文献1)、Rho激酶抑制剂(专利文献2)、血栓调节素蛋白(专利 文献3)、胆红素(专利文献4) ,PPAR γ活化剂(专利文献5)、伊马替尼(专利文献6)、干扰 素Y (专利文献7)等药剂在肺纤维化动物模型或临床试验中收到了某种程度的成果。但 是，任一药剂均不令人满意，需要进一步开发肺纤维化治疗剂。现有技术文献专利文献1 日本特开平8-268906号公报专利文献2 国际公开第00/57913号小册子专利文献3 日本特开2002-371006号公报专利文献4 日本特开2003-119138号公报专利文献5 日本特表2005-513031号公报专利文献6 日本特表2005-531628号公报
专利文献7 日本特表2006-502153号公报专利文献8 国际公开第2006/068232号小册子非专利文献1 =Ann Intern Med. 2001 ； 134 (2) 136-5
发明内容
本发明的目的在于提供能够特异性地将药物等物质递送至肺的细胞外基质产生 细胞的载体、利用了该载体的肺纤维化处置剂和肺纤维化的处置方法。本发明人等在研究新型肺纤维化治疗剂的过程中发现，通过投予在含有类视黄醇 的载体上担载有细胞外基质产生抑制剂的组合物，可以有效地处置肺纤维化，进而完成了 本发明。已知含有维生素A的载体将药物递送至储存维生素A的星状细胞中(参照专利文 献8)，但对于其与肺纤维化的关系，目前完全是未知的。SP，本发明涉及以下内容(1) 一种靶向肺的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为 靶向剂。(2)上述⑴所述的载体，其中，类视黄醇衍生物包含视黄醇。(3)上述(1)或⑵所述的载体，其中，类视黄醇的含量为载体总量的0.2 20重量％。(4)上述(1) (3)任一项所述的载体，其具有脂质体的形态，且类视黄醇与脂质 体中所含脂质的摩尔比为8 1 1 4。(5) 一种肺纤维化处置用组合物，其含有上述(1) (4)任一项所述的载体和控制 肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物。(6)上述(5)所述的组合物，其中，控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的 药物选自从明胶酶A、明胶酶B和血管紧张素原中选择的生理活性物质的活性或产生抑制 剂、细胞活性抑制剂、增殖抑制剂、凋亡诱导剂、以及以细胞外基质构成分子或与该细胞外 基质构成分子的产生或分泌有关的分子的至少1个为靶的siRNA、核酶、反义核酸、DNA/RNA 嵌合多核苷酸和表达它们的载体(vector)。(7)上述(6)所述的组合物，其中，与细胞外基质构成分子的产生或分泌有关的分 子为HSP47。(8)上述(5) (7)任一项所述的组合物，其是在医疗现场或其附近将药物和载体 混合而成的。(9)上述(5) (8)任一项所述的组合物的制备试剂盒，其包含单独含有或组合含 有下述物质的1个或多个容器，所述物质为控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖 的药物、类视黄醇、以及根据需要使用的除类视黄醇以外的载体构成物质。本发明的肺纤维化处置用组合物的准确作用机制虽然目前还不完全清楚，但可以 认为是由于类视黄醇作为靶向成纤维细胞或肌成纤维细胞等肺的细胞外基质产生细胞的 靶向剂发挥功能，将有效成分、例如控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物等 递送至该成纤维细胞或肌成纤维细胞等肺的细胞外基质产生细胞，由此发挥抗肺纤维化效^ ο
因此，通过本发明的载体，由于能够将有效成分有效地递送至作用部位、进而递送 至靶细胞，因此肺纤维化、特别是之前难以治疗的特发性间质性肺炎等的治愈、抑制发展或 预防发病成为可能，对人类医疗和动物医疗的贡献极大。另外，本发明的载体由于能够与任意的药剂(例如现有的肺纤维化治疗药物)相 组合并提高其作用效率，因此还具有制剂的应用范围广、能够简便地制造有效的处置剂的 优点。
图1为表示大鼠的肺纤维化的引发和药剂的投予计划的示意图。图2为表示博来霉素投予后第21天的BAL液中的总细胞数的图。正常对照(对 照)是未投予博来霉素的正常大鼠。图3为表示博来霉素投予后第21天的肺羟脯氨酸量(HP)的图。正常对照(对 照)是未投予博来霉素的正常大鼠。图4为表示博来霉素投予后第21天的肺组织的HE染色图像的照片图。图5为表示博来霉素投予后第21天的肺组织的偶氮卡红染色(Azan stain)图像 的照片图。图6为表示博来霉素投予后第21天的肺组织的α SMA阳性细胞的分布的照片图。
具体实施例方式本发明中，肺的细胞外基质产生细胞只要是存在于肺的具有细胞外基质产生能力 的细胞，则无特别限定，例如包含存在于肺的成纤维细胞或肌成纤维细胞。作为存在于肺的 成纤维细胞，例如可举出血管外膜成纤维细胞或细支气管外膜成纤维细胞等。存在于肺的 肌成纤维细胞不仅包含来源于如此存在于肺的成纤维细胞的肌成纤维细胞，还可包含来源 于循环血液中的成纤维细胞的肌成纤维细胞或通过内皮间充质转化由内皮细胞转化来的 肌成纤维细胞。肌成纤维细胞以表达a-SMA(a平滑肌肌动蛋白)为特征。本发明中的肌 成纤维细胞通过使用了经可检测地标记的抗α-SMA抗体的免疫染色等来鉴定。另外，成纤 维细胞由于在间充质细胞中表达特征性的波形蛋白而不表达α -SMA,因此可以通过波形蛋 白和α -SMA的双重染色等来鉴定。本发明中的类视黄醇只要促进靶向肺的细胞外基质产生细胞的物质递送，则无特 别限定，例如可使用视黄醇(维生素Α)、阿维A酯、维生素A酸、异维生素A酸、阿达帕林、阿 曲汀、他扎罗汀、视黄醇棕榈酸酯等类视黄醇衍生物、以及芬维A胺(4-HPR)、蓓萨罗丁等维 生素A类似物。本发明中的类视黄醇促进靶向肺的细胞外基质产生细胞的特异性物质递送。类视 黄醇促进物质递送的机制虽然还不完全清楚，但可以认为例如特异性结合于RBP (视黄醇 结合蛋白，retinol binding protein)的类视黄醇借助位于肺的细胞外基质产生细胞的细 胞表面上的某种受体而被摄入该细胞中。类视黄醇是具有4个类异戊二烯单元连接成头尾式的骨架的化合物群中的1员 (参照G. P. Moss,"Biochemical Nomenclature and Related Documents, "2nd Ed. Portland Press, pp. 247-251 (1992))，维生素A是定性地表示视黄醇的生物学活性的类视黄醇的通常的描述。作为本发明中可以使用的类视黄醇，并无特别限定，例如可举出视黄醇、视黄 醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯、脂肪族醇与视黄酸的酯、阿维A酯、维生素A酸、异维生 素A酸、阿达帕林、阿曲汀、他扎罗汀、视黄醇棕榈酸酯等类视黄醇衍生物、以及芬维A胺 (4-HPR)、蓓萨罗丁等维生素A类似物。其中，从靶向肺的细胞外基质产生细胞的特异性物质递送的效率的方面出发，优 选视黄醇、视黄醛、视黄酸、视黄醇与脂肪酸的酯(例如视黄醇醋酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视 黄醇硬脂酸酯和视黄醇月桂酸酯等)以及脂肪族醇与视黄酸的酯(例如视黄酸乙酯等)。包括类视黄醇的顺式_反式的全部异构体均在本发明的范围内。类视黄醇还可被 1个或2个以上的取代基取代。本发明中的类视黄醇当然包括处于经分离的状态的类视黄 醇，还包括溶解或混合于可将其溶解或保持的介质中的状态的类视黄醇。本发明的载体可以由这些类视黄醇本身构成，还可通过使类视黄醇结合或包含于 与其不同的其他的载体构成成分而构成。因此，本发明的载体还可含有除类视黄醇以外的 载体构成成分。作为该成分，并无特别限定，可以使用在医药和药学领域中已知的任意的成 分，优选可包含类视黄醇或者可与其相结合的成分。作为这种成分，可举出脂质、例如甘油磷脂等磷脂、鞘磷脂等鞘脂、胆固醇等甾醇、 大豆油、罂粟油等植物油、矿物油、蛋黄卵磷脂等卵磷脂类等，但并不限定于这些。其中优选 可构成脂质体的物质，例如卵磷脂等天然磷脂、二肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂 酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)等半合成磷脂、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、 二月桂酰磷酯酰胆碱(DLPC)、胆固醇等。作为特别优选的成分，可举出可避免被网状内皮系统捕获的成分，例如Ν-(α-三 甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酸酯氯化物(TMAG)、Ν，N，，N”，N，，，-四甲基-N， N’，N”，N”’ -四棕榈酰基精胺(TMTPS)、2，3-二油酰氧基-Ν-[2(精胺羧酰胺基)乙基]-N， N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(DOSPA)、Ν-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基 氯化铵(D0TMA)、二 (十八烷基)二甲基氯化铵(DODAC)、二(十二烷基)溴化铵(DDAB)U, 2_ 二油酰氧基-3-三甲基铵基丙烷(DOTAP)、3 β-[Ν-(Ν，，Ν，_ 二甲基氨基乙烷)氨基甲酰 基]胆固醇(DC-Chol)、1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)、0，0，- 二 (十四烷酰基-Ν_( α-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺氯化物(DC-6-14)等阳离子性脂质。类视黄醇对本发明载体的结合或包含还可以通过利用化学和/或物理的方法使 类视黄醇结合或包含于载体的其他构成成分中。或者，类视黄醇对本发明载体的结合或包 含还可以通过在制作该载体时将类视黄醇与除其以外的载体构成成分相混合来进行。结 合或包含于本发明载体的类视黄醇的量以载体构成成分中的重量比计可以为0.01% 100%,优选为0. 2% 20%、更优选为为1 5%。类视黄醇对载体的结合或包含可以在使 药物等担载于该载体之前进行，还可以通过将载体、类视黄醇衍生物等和药物等同时混合 等来进行，或者还可以通过将已经担载了药物等的状态的载体与类视黄醇衍生物等相混合 等来进行。因此，本发明还涉及一种肺的细胞外基质产生细胞特异性制剂的制造方法，其包 含使类视黄醇与现有的任意药物结合载体或药物包封载体、例如DaimoXome (注册商标)、 Doxil、Caelyx (注册商标)、Myocet (注册商标)等脂质体制剂结合的工序。本发明载体的形态只要是能够将所需的物质或物体搬送至成为靶的肺的细胞外 基质产生细胞，则可以是任意状态，对此并无限定，例如可以采用高分子胶束、脂质体、乳剂、微球、纳米球等中的任一种形态。本发明中，从递送效率高、可递送的物质的选择范围宽 或制剂的容易性等的观点出发，优选其中的脂质体的形态，特别优选含有阳离子性脂质的 阳离子性脂质体。当载体为脂质体的形态时，考虑到类视黄醇在载体中的结合或包含的效 率性时，类视黄醇与除其以外的脂质体构成脂质的摩尔比优选为8 1 1 4、进一步优 选为4 1 1 2、更优选为3 1 1 1、特别优选为2 1。本发明的载体只要其所含的类视黄醇以作为靶向剂发挥功能的方式存在，则可以 在内部含有搬送物、还可附着在搬送物的外部而存在、另外还可与搬送物混合。在此，作为 靶向剂发挥功能是指含有类视黄醇的载体相比较于不含类视黄醇的载体，更为迅速且/或 更为大量地到达且/或被摄入至作为靶细胞的肺的细胞外基质产生细胞，这可通过例如在 靶细胞的培养物中添加带有标记或含有标记的载体、并在规定时间后分析标记的存在部位 来容易地确认。从结构上来说，例如只要类视黄醇在最迟到达靶细胞之前至少部分地露出 至含有载体的制剂的外部，则可满足上述要件。类视黄醇是否露出至制剂的外部可以通过 使制剂与和类视黄醇特异性结合的物质、例如视黄醇结合蛋白(RBP)等接触、并调查对制 剂的结合来进行评价。本载体所递送的物质或物体并无特别限定，优选是能够在生物体内从投予部位向 靶细胞所存在的病变部位物理地移动的大小。因此，本发明的载体可以搬送原子、分子、化 合物、蛋白质、核酸等物质，还可搬送载体、病毒粒子、细胞、由1个以上要素构成的药物释 放系统、微机械等物体。上述物质或物体优选具有对靶细胞造成某些影响的性质，例如包含 标记靶细胞的物质或物体、控制靶细胞的活性或增殖(例如使其增强或将其抑制)的物质 或物体。因此，在本发明的一个方式中，载体所递送的物质是“控制肺的细胞外基质产生 细胞的活性或增殖的药物”。这里，肺的细胞外基质产生细胞的活性是指肺的细胞外基质 产生细胞所表现的分泌、摄入、游走等各种活性，但在本发明中典型地是指其中的特别是 与肺纤维化的发病、发展和/或复发等有关的活性。作为该活性，例如可无限定地举出明 胶酶A和B (分别为MMP2和9)、血管紧张素原等生理活性物质、胶原、蛋白多糖、肌腱蛋白 (tenascin)、纤维粘连蛋白、血小板反应蛋白、骨桥蛋白、骨连接蛋白、弹性蛋白等细胞外基 质成分等的产生和分泌。因此，控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物可以是直接或间接 地抑制与肺纤维化的发病、发展和/或复发有关的这些细胞的物理、化学和/或生理作 用等的任何药物，无限定地包括抑制上述生理活性物质的活性或产生的药物、巴马司他 (batimastat)等MMP抑制剂、和中和上述生理活性物质的抗体和抗体片断、抑制上述生理 活性物质的表达的siRNA、核酶、反义核酸(包括RNA、DNA、PNA或它们的复合物)等物质、或 显性负性突变体等具有显性负性效果的物质或者表达它们的载体，抑制上述细胞外基质成 分等的产生和分泌的药物，例如抑制细胞外基质成分的表达的siRNA、核酶、反义核酸(包 括RNA、DNA、PNA或它们的复合物)等物质、或显性负性突变体等具有显性负性效果的物质 或者表达它们的载体，钠通道阻断剂等细胞活性抑制剂、烷基化剂(例如异环磷酰胺、尼莫 司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、雷莫司汀等)、抗肿瘤性抗生素(例如依达比星、表柔比 星、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、米托蒽醌、丝裂霉素C等)、代谢拮 抗剂(例如、吉西他滨、依诺他滨、阿糖胞苷、优福定、TS-I配合剂、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯嘌呤等)、依托泊甙、伊立替康、长春瑞滨、多西他赛水和物、紫杉醇、长 春新碱、长春地辛、长春碱等生物碱以及卡钼、顺钼、奈达钼等钼络合物等细胞增殖抑制剂、 以及compound 861、胶霉毒素、洛伐他汀、贝拉康坦等凋亡诱导剂。另外，本发明中的“控制 肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物”可以是直接或间接地促进与抑制肺纤维化 的发病、发展和/或复发直接或间接有关的肺的细胞外基质产生细胞的物理、化学和/或生 理作用等的任何药物。作为本发明载体的递送物，还可以无限定地举出抑制肺纤维化的发病、发展和/ 或复发的除上述以外的药物，例如可无限定地举出秋水仙碱、D-青霉胺、吡非尼酮(5-甲 基-1-苯基-2-[1Η]_吡啶酮)、干扰素β la、松弛素、N-乙酰半胱胺酸、角化细胞生长因子、 卡托普利、肝细胞生长因子、Rho激酶抑制剂、血栓调节素蛋白、胆红素、PPARy活化剂、伊 马替尼、干扰素Y、TGFii受体激酶抑制剂等。本发明的载体所递送的物质或物体可以经过标记或者未经标记。通过标记化，可 以监测搬送是否成功或者靶细胞的增减等，特别是在试验和研究水平上是有用的。标记可 以从本领域技术人员公知的任意物质、例如任意的放射性同位素、磁性体、结合于标记化物 质的物质(例如抗体)、荧光物质、荧光团、化学发光物质和酶等中选择。本发明中“肺的细胞外基质产生细胞用”或“肺的细胞外基质产生细胞递送用”是 指适于将肺的细胞外基质产生细胞作为靶细胞使用，其包括例如与其他细胞、例如正常细 胞相比能够将物质更为迅速、高效且/或大量地递送至肺的细胞外基质产生细胞中。例如， 本发明的载体能够将物质以相比较于其他细胞为1. 1倍以上、1. 2倍以上、1. 3倍以上、1. 5 倍以上、2倍以上、进而3倍以上的速度和/或效率递送至肺的细胞外基质产生细胞中。本发明还涉及含有上述载体、上述控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的 药物且用于控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖、或者用于处置肺纤维化的组合 物，以及上述载体在制造这些组合物中的用途。本发明中，肺纤维化不仅包括狭义的肺纤维化，还包括含有与间质性肺炎并存的 广义的肺纤维化。本发明中的肺纤维化可由任意的间质性肺炎、例如伴随病毒性肺炎、真菌 性肺炎、支原体肺炎等的感染性间质性肺炎、伴随类风湿关节炎、系统性硬皮病、皮肌炎、多 发性肌炎、混合性结缔组织病(MCTD)等胶原病的间质性肺炎、伴随放射线暴露的间质性肺 炎、博来霉素等抗癌剂、小柴胡汤等中药、干扰素、抗生素、百草枯等导致的药源性间质性肺 炎、特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎、急性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎、呼吸性细 支气管炎相关性间质性肺病、脱屑性间质性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎等特发性间质性 肺炎等引起，因此包括这些间质性肺炎发生了慢性化的病症。本发明中的肺纤维化优选包 括药源性间质性肺炎和特发性间质性肺炎发生了慢性化的病症。本发明的组合物中，只要载体中所含的类视黄醇是以作为靶向剂发挥功能的方式 存在，则载体可在其内部含有递送物、也可附着在递送物的外部而存在、另外还可与递送物 相混合。因此，可以根据投予路径或药物释放方式等，用适当的材料、例如肠溶性包衣或者 时限崩解性材料将上述组合物包覆，另外，还可并入适当的药物释放系统中。本发明的组合物可以通过包含经口和非经口两者的各种路径投予，例如可无限定 地通过经口、静脉内、肌肉内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、直肠内、动 脉内、门静脉内、心室内、骨髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、髓腔内、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫内等路径投予，还可以制成适于各投予路径的剂型。该剂型和制剂方法 可以适当采用任意公知的剂型和方法(例如参照標準薬剤学、渡边喜照等编、南江堂、2003 年等)。例如作为适于经口投予的剂型，可无限定地举出散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液 齐U、悬浮剂、乳剂、凝胶剂、糖浆剂等，另外作为适于非经口投予的剂型，可举出溶液性注射 剂、悬浮性注射剂、乳浊性注射剂、用时制备型注射剂等注射剂。非经口投予用制剂可以是 水性或非水性的等渗性无菌溶液或悬浮液的形态。本发明的载体或组合物可以以任意的形态供给，但从保存稳定性的观点出发，优 选为可用时制备的形态，例如以在医疗现场或其附近可由医生和/或药剂师、护士或其他 医学辅助人员等进行制备的形态来提供。此时，本发明的载体或组合物以1个或2个以上 的含有其中所需的构成要素的至少1个的容器的形式提供，在使用之前、例如24小时前以 内、优选3小时前以内、进一步优选在马上要使用之前进行制备。在进行制备时，可以适当 使用在进行制备的场所通常可获得的试剂、溶剂、调剂器具等。因此，本发明还涉及一种载体或组合物的制备试剂盒，其包含单独或组合含有类 视黄醇和/或递送物和/或除类视黄醇以外的载体构成物质的1个或2个以上的容器，另 外，本发明还涉及以这种试剂盒的形态提供的载体或组合物的必要构成要素。本发明的试 剂盒除了上述之外，还可含有与本发明的载体和组合物的制备方法或投予方法等有关的说 明书、或者CD、DVD等电子记录介质等。另外，本发明的试剂盒还可含有用于完成本发明的 载体或组合物的全部构成要素，也可并非含有全部的构成要素。因此，本发明的试剂盒也可 含有在医疗现场或实验设施等处通常可获得的试剂或溶剂、例如无菌水、生理盐水、葡萄糖 溶液等。本发明还涉及用于控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖、或者用于处置肺 纤维化的方法，其包括将上述组合物的有效量投予给需要该组合物的对象。这里，有效量例 如对于后者而言，是指抑制肺纤维化的发病或复发、减轻症状或者延缓或停止发展的量，优 选为预防肺纤维化的发病和复发或者将其治愈的量。另外，优选为不会发生超过投予所产 生的利益的不良影响的量。该量可以通过使用了培养细胞的体外(in vitro)试验或者大 鼠、小鼠、狗或猪等模型动物的试验来适当决定，这种试验方法被本领域技术人员所熟知。 另外，载体中所含的类视黄醇和本发明的方法中所用药物的用量是本领域技术人员公知 的，或者可以通过上述试验等适当决定。本发明的方法中所投予的组合物的具体用量可以考虑与需要处置的对象有关的 各种条件、例如症状的严重程度、对象的一般健康状态、年龄、体重、对象的性别、饮食、投予 时期和频率、并用的药品、对治疗的反应性、以及对治疗的依从性等来决定。作为投予路径，包括包含经口和非经口两者的各种路径，例如包括经口、静脉内、 肌肉内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、经鼻、直肠内、动脉内、门静脉内、心室 内、骨髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、髓腔内、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹腔内和子宫 内等路径。投予频率根据所用组合物的性状、上述对象的条件而不同，例如可以是1日多次 (即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、数日1次(即每2、3、4、5、6、7日1次等)、1周数 次(例如1周2、3、4次等)、1周1次、数周1次(即每2、3、4周1次等)。
本发明的方法中，用语“对象”是指任意的生物个体，优选为动物、更优选为哺乳动 物、进一步优选为人的个体。本发明中，对象可以是健康的，也可以患有某种疾病，但在要进 行肺纤维化的处置时，典型地是指患有间质性肺炎或肺纤维化、或者具有患这种病的危险 的对象。例如，在希望预防肺纤维化时，患有间质性肺炎、特别是特发性间质性肺炎的对象 无限定地成为典型例。另外，用语“处置”包含以疾病的治愈、暂时的缓解或预防等为目的的医学上可允 许的全部种类的预防和/或治疗性的介入。例如，“处置”的用语包括包含肺纤维化发展的 延迟或停止、病变的退缩或消失、肺纤维化发病的予防或复发的防止等的各种目的的医学 上可允许的介入。本发明还涉及利用了上述载体的靶向肺的细胞外基质产生细胞的药物递送方法。 该方法无限定地包含例如下述工序使递送物担载在上述载体上的工序；将担载了递送物 的载体投予或添加至含有肺的细胞外基质产生细胞的生物或介质、例如培养基等中的工 序。这些工序可以通过公知的任意的方法或者本说明书所记载的方法等适当实现。上述递 送方法还可与其他的递送方法、例如以肺为靶的其他递送方法等相组合。另外，上述方法既 包括体外进行的形态，也包括以体内的肺的细胞外基质产生细胞为靶的形态。实施例以下，根据具体例子进一步说明本发明，但该具体例为本发明的示例，并非限定本 发明。实施例IsiRNA的制作从北海道System Science购入以属于人HSP47的大鼠同系物的gp46 (GenBank Accession No. M69246)为靶的 3 种 siRNA 和作为对照的 randomsiRNA。各 siRNA 由在 3， 侧具有突出端的27个碱基构成，序列如下所示。序列A 5，-⑶UCCACCAUAAGAUGGUAGACAACAG-3，(正义、序列号1)5，-⑶UGUCUACCAUCUUAUGGUGGAACAU-3，(反义、序列号2)序列B :5，-CCACAA⑶UUUAUAUCCAAUCUAGCAG-3，(正义、序列号3)5，-GCUAGAUUGGAUAUAAAACUUGUGGAU-3，(反义、序列号4)序列C :5，-CUAGAGCCAUUACAUUACAUUGACAAG-3，(正义、序列号5)5，-U⑶CAAUGUAAUGUAAUGGCUCUAGAU-3，(反义、序列号6)random siRNA :5，-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3，(正义、序列号7)5，-GCAAUGAAGCCGGUCUAGCGAAUCGAU-3，(反义、序列号8)另外，还制作了在5’侧标记了荧光色素6’ -羧基荧光素(6-FAM)的siRNA。
实施例2含siRNA的VA结合脂质体的制作 作为脂质体，使用以4 3 3的摩尔比含有DC-6-14、胆固醇和DOPE的阳离子 性脂质体(Lipotrust、北海道System Science)。用1. 5ml管在DMSO中混合IOnmol的脂 质体和20nmol的维生素A(VA 全反式视黄醇、Sigma)后，用氯仿溶解，暂时蒸散后，悬浮于 PBS中。之后，以1 1 (w/w)的比例混合实施例1中获得的SiRNAdOy g/ml)和脂质体悬 浮液。利用 Micropartition system(Sartorion VIVASPIN 5000MWC0 PES)将所得脂质体 悬浮液中所含的游离VA和siRNA除去，获得含siRNA的VA结合脂质体(VA_lip-siRNA)。 利用HPLC法测定所添加的VA量和精制脂质体内所含的VA量，研究结合于脂质体的VA的比例，结果可知，VA的大部分(95. 6士0.42%)结合于脂质体。另外，利用RiboGreen assay (MolecularProbes)测定siRNA在脂质体中的摄入效率，结果高达94. 4士3. 0%。另 外，该制剂是使VA至少部分露出至制剂外部的制剂。实施例3体内(in vivo)的含siRNA的VA结合脂质体的抗肺纤维化活性(1)肺纤维化的引发和药剂的投予对S-D雄性大鼠(1组6只、4周龄、Charles River)在麻醉下在气管内插入插管， 经气管肺内投予1次将博来霉素(BLM) 0. 5mg溶解于0. 5cc生理盐水所得到的物质，制作博 来霉素肺纤维化模型。通过该方法，通常在3周左右肺会发生显著的纤维化。从投予博来 霉素的当天开始，以3次/周的频率由尾静脉投予实施例2中所制备的VA-lip-siRNA(以 siRNA量计为0. 75mg/kg、以容量计为lml/kg、即200g大鼠投予200 μ 1)或PBS(lml/kg的 容量)。在投予博来霉素后第21天使动物安乐死，进行支气管肺泡洗涤(BAL)液的分析、 肺内羟脯氨酸的定量和肺组织的组织学研究(参照图1)。其中，统计学显著性的评价使用 Student' st 检验。(2) BAL液的分析BAL如下进行。即，对动物腹腔内投予致死量的戊巴比妥钠后开胸，使气管露出，在 气管内插入插管。之后，通过气管插管将7ml的生理盐水注入肺中，将其洗涤液回收。重复 5次该注入、回收操作，将回收的洗涤液合并，以250Xg离心10分钟。总细胞数使用血细胞 计数板计数，细胞分级的计数利用通过经梅吉染色(May-Giemsa stain)的细胞离心的涂抹 标本进行。细胞最少计数200个，根据通常的形态标准，分类为巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜 中性粒细胞、淋巴细胞。总细胞数的计数结果示于图2。由该图可知，BAL液中的细胞数在 VA-lip-siRNA投予组(BLM siRNA)中与代替博来霉素而投予PBS的正常对照大鼠(对照) 为相同程度，与PBS投予组(BLM单独)相比显著地降低，可知炎症有所改善。(3)肺组织中的羟脯氨酸的定量在BAL后将肺摘出，使用Polytron勻浆机将整个肺片勻浆，利用Kivirikko等人 的方法(Kivirikko KI，et al. Analytical biochemistry 1967 ；19 :249_255)定量肺羟脯 氨酸。即，在6N盐酸中于110°C下将肺组织勻浆，在60°C下干燥25μ1的等分量。用1. 2ml 的50%异丙醇将其溶解，用pH6. O的醋酸盐枸橼酸盐(acetate citrate)、0. 56%的氯胺T 溶液200ml在室温下孵育10分钟后，添加Iml的Ehrlich液，在50°C下孵育90分钟，测定 560nm的吸光度。根据图3所示的结果可知，肺羟脯氨酸量(μ g)在VA-lip-siRNA投予组 (BLM siRNA)中与PBS投予组(BLM单独)相比显著地降低，可知显著地抑制了肺的纤维化。(4)组织学研究按照常规方法将摘出肺的一部分进行甲醛固定，供至苏木精伊红(HE)染色、偶氮 卡红染色(偶氮胭脂红、苯胺蓝橙G液)或利用抗α SMA抗体的免疫染色。免疫染色是在 脱石蜡后，以小鼠抗α -SMA抗体(Nichirei、Clone 1A4)作为一抗、接着以过氧化物酶标记 抗小鼠IgG作为二抗使其分别反应，利用DAB使其显色。如图4的HE染色结果所示，PBS投 予组(BLM第21天)可见肺泡消失、出血像和间质增生等肺纤维化的特征性所见，而与此相 对，VA-lip-siRNA投予组(BLM+siRNA)中纤维化病变显著地改善。同样地，如图5的偶氮 卡红染色结果所示，PBS投予组(BLM单独)中可见以被染色成蓝色的大量胶原纤维导致的 间质扩大为特征的显著的纤维化图像，而与此相对，VA-lip-siRNA投予组(BLM+siRNA)中
11纤维化被明显地抑制。另外，如图6的aSMA染色结果所示，PBS投予组(BLM单独)中在 间质中可见多个呈褐色的α SMA阳性细胞，而与此相对，VA-lip-siRNA投予组(BLM+siRNA) 中α SMA阳性细胞明显减少。 如果考虑到SiRNA基本上在细胞质内发挥作用，则以上结果表明通过类视黄醇 作为靶向肺的细胞外基质产生细胞的靶向剂发挥功能、并有效地将药物递送至该细胞中， 显著地改善了肺纤维化的病态。
1权利要求
一种靶向肺的细胞外基质产生细胞的物质递送用载体，其含有类视黄醇作为靶向剂。
2.根据权利要求1所述的载体，其中，类视黄醇衍生物含有视黄醇。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，类视黄醇的含量为载体总量的0.2 20重量％。
4.根据权利要求1 3任一项所述的载体，其具有脂质体的形态，且类视黄醇与脂质体 中所含脂质的摩尔比为8 1 1 4。
5.一种肺纤维化处置用组合物，其含有权利要求1 4任一项所述的载体和控制肺的 细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖 的药物选自从明胶酶A、明胶酶B和血管紧张素原中选择的生理活性物质的活性或产生抑 制剂、细胞活性抑制剂、增殖抑制剂、凋亡诱导剂、以及以细胞外基质构成分子或与该细胞 外基质构成分子的产生或分泌有关的分子的至少1个为靶的siRNA、核酶、反义核酸、DNA/ RNA嵌合多核苷酸和表达它们的载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，与细胞外基质构成分子的产生或分泌有关的 分子为HSP47。
8.根据权利要求5 7任一项所述的组合物，其是在医疗现场或其附近将药物和载体 混合而成的。
9.权利要求5 8任一项所述的组合物的制备试剂盒，其包含单独或组合含有下述物 质的1个或多个容器，所述物质为控制肺的细胞外基质产生细胞的活性或增殖的药物、类 视黄醇、以及根据需要使用的除类视黄醇以外的载体构成物质。
全文摘要
本发明涉及含有类视黄醇的肺的细胞外基质产生细胞用物质递送载体、利用了该载体的肺纤维化处置剂以及该处置剂的制备试剂盒。
文档编号A61K48/00GK101977629SQ200980109550
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月16日 优先权日2008年3月17日
发明者新津洋司郎, 泷本理修 申请人:日东电工株式会社