子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型造模方法
【专利摘要】本发明公开一种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造模方法，属于医疗评价、检测技术领域。该方法将健康Wistar雌性大鼠进行卵巢切除手术后，通过外源皮下注射雌激素21天进行造模，且通过大鼠体内血清17β?雌二醇水平、子宫重量和形态、乳腺形态和血管通透性指标的检测，判定该方法造模与子宫、乳腺异常增生和血管通透性提高病症诊断标准相符合的目的，使临床与基础研究达到一致性。此模型无其他明显器质性病变的出现，在子宫和乳腺增生的病理生理及防治药物研发和在血管通透性提高导致血管渗出、水肿及癌转移抑制研究方面是一个十分重要和理想的动物模型。
【专利说明】
子宫和乳腺异常増生及血管通透性提高大鼠模型造模方法
技术领域
[0001] 本发明属于医疗评价、检测技术领域，涉及一种动物模型的造模方法，具体涉及一 种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造模方法。
【背景技术】
[0002] 雌性激素分泌异常会导致乳腺增生、子宫内膜增生、子宫肌瘤和乳腺癌及子宫内 膜癌发生，该方面的病理生理学研究和防治药物研发一直是人们十分关注的话题。该方面 理想动物模型的建立有着十分重要的意义。
[0003]雌性激素分泌异常导致血管通透性的提高是多种雌激素相关性疾病发生的主要 原因，如血清雌激素水平过高易产生血管渗出、水肿及卵巢过激综合征，还可诱发子宫内膜 癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌及肺癌等的发生和转移，研究雌激素紊乱的治疗药物的临床前 研究需要使动物处于子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高的状态，因此我们发明一种子 宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造模方法，为临床雌激素相关性疾病发病 机制分析及预防治疗提供理论指导。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造 模方法，依照该造模方法得到的大鼠模型有助于临床雌激素相关性疾病发病机制分析及预 防和治疗。
[0005] 为了实现上述目的，采用以下的技术方案予以实现：
[0006] -种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造模方法，包括以下步 骤：
[0007] -种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型的造模方法，其特征在于， 具体包括以下步骤：
[0008] ⑴将50-55日龄的清洁级雌性Wistar大鼠，随机分成5组，每组15只，同组放入一笼 中，5组大鼠均在室内温度25 °C、相对湿度54 %的饲养室饲养7天；
[0009] ⑵在无菌条件下，选4组大鼠进行卵巢切除术，剩余组进行假手术;卵巢切除术具 体是先用盐酸氯胺酮80mg/kg腹腔注射麻醉，再沿着背部脊柱两侧切口，单侧切口距脊柱 lcm、距最后肋骨1.5cm，切口长1.5-2cm，切开皮肤和肌肉层后放入定高切口保护器扩张肌 肉层，所述定高切□保护器通道直径1.5cm，找到卵巢，近端输卵管上做两个结扎，将卵巢切 除(〇vx)，滴数滴青霉素注射液以防止感染，逐层缝合创口，术后用无菌〇.9%NaCl注射液配 置青霉素注射液0.8万U/ml，每只大鼠lml腹腔注射，每天1次，连续注射3天，以防止腹腔感 染，术后原笼饲养；
[0010] ⑶恢复一周后，分别标记5组为:假手术(Sham)、卵巢切除(Ovx)、卵巢切除+170-雌 二醇0 ? 01mg/kg体重（Ovx+EstO ? 01)、卵巢切除+170-雌二醇0 ? lmg/kg体重（Ovx+EstO ? 1)、卵 巢切除+170-雌二醇lmg/kg体重(0vx+Estl);第一组和第二组大鼠每天皮下注射0.2ml芝麻 油，作为对照;第三组至第五组大鼠每天皮下注射不同剂量的170-雌二醇芝麻油溶液；
[0011] ⑷21天后，测定大鼠血清雌二醇水平、子宫重量及形态结构、乳腺形态的变化以确 定其增生情况，测定子宫内膜中嗜酸性粒细胞渗出量和大鼠视网膜EB渗出量的变化以确定 其血管通透性的变化情况，基于增生情况和血管通透性变化情况的结果综合判定模型成功 度。
[0012] 本发明的有益技术效果:采取以背部两侧开口切除大鼠卵巢的措施去除内源性雌 激素的作用，使实验大鼠生理周期同步化，减少误差，再通过皮下注射外源170-雌二醇21 天进行造模，然后结合子宫重量、子宫形态、乳腺形态及血管通透性分析检测结果判定模型 的成功度;该方法快速高效、成功率高，得到的子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠 模型状态平稳，无其他明显器质性病变的出现，是雌激素紊乱的治疗药物临床前研究的良 好实验材料，有助于临床雌激素相关性疾病发病机制分析及预防治疗的直接研究，尤其是 在子宫和乳腺增生的病理生理及防治药物研发和在血管通透性提高导致血管渗出、水肿及 癌转移抑制研究方面是一个十分重要和理想的动物模型。
【附图说明】
[0013] 图1A-E为雌二醇诱发的去卵巢大鼠子宫形态变化；注：与Sham组相比表示p〈 0 ? 05;与Ovx组相比：A表示p〈0 ? 05;m表示p〈0 ? 01。
[0014]图2为卵巢切除大鼠（Ovx)、假手术大鼠（Sham)和雌二醇Est处理后卵巢切除大鼠 子宫内膜形态变化切片图；g，子宫腺体;C，被覆上皮细胞;UC，宫腔;gee，腺上皮细胞。HE染 色。
[0015]图3为雌二醇Est处理后卵巢切除大鼠子宫乳腺形态变化切片图。
[0016] 图4-1为雌二醇对去卵巢大鼠子宫嗜酸性粒细胞渗出的影响；与假手术Sham组比 较:*#P〈0.001;与卵巢切除组Ovx比较: +++P〈0.001。
[0017] 图4-2为雌二醇Est处理后卵巢切除大鼠子宫炎性细胞渗出形态切片图。
【具体实施方式】
[0018] 为了证明该种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型造模方法的成功 有效性，进行了以下实验：
[0019] 1材料 [0020] 1.1实验动物
[0021]健康雌性Wistar大鼠，50-55日龄，由兰州大学动物实验中心提供，许可证号： SCKX(甘）2014-0001。
[0022] 1.2药品、试剂及溶液配制
[0023] 170-雌二醇（170-estradiol，Est)，Sigma公司产品，用芝麻油溶解配制。
[0024] 1.3仪器
[0025] 光学显微镜（Olympus Vanox)
[0026] 图像分析系统
[0027] BL-420+智能型生物信号显示与处理系统(成都泰盟电子有限公司）
[0028] IBM兼容机
[0029] 万分之一电子天平 [0030] 组织包埋机 [0031] 病理切片机 [0032] 2 方法 [0033] 2.1动物造模方法
[0034] 将50-55日龄的健康雌性Wistar大鼠，随机分成5组，每组15只，同组放入一笼中，5 组大鼠均在室内温度25°C、相对湿度54%的饲养室饲养7天。在无菌条件下，选4组大鼠进行 卵巢切除术，剩余组进行假手术；卵巢切除术具体是先用盐酸氯胺酮80mg/kg腹腔注射麻 醉，再沿着背部脊柱两侧切口，单侧切口距脊柱lcm、距最后肋骨1.5cm，切口长1.5-2cm，切 开皮肤和肌肉层后放入定高切口保护器扩张肌肉层，所述定高切口保护器通道直径1.5cm， 找到卵巢，近端输卵管上做两个结扎，将卵巢切除(〇vx)，滴数滴青霉素注射液以防止感染， 逐层缝合创口，术后用无菌0.9%NaCl注射液配置青霉素注射液0.8万U/ml，每只大鼠lml腹 腔注射，每天1次，连续注射3天，以防止腹腔感染，术后原笼饲养。恢复一周后，分别标记5组 为：
[0035]第一组:假手术(Sham)，每天皮下注射0.2ml芝麻油，N= 15，作为正常对照；
[0036]第二组:卵巢切除(Ovx)，每天皮下注射0.2ml芝麻油，N= 15，作为空白对照；
[0037] 第三组:卵巢切除+170-雌二醇(Ovx+Est0.0 1)，每天皮下注射0.2ml Est芝麻油溶 液，剂量为〇.〇lmg/kg体重，N=15;
[0038] 第四组：卵巢切除+170-雌二醇(Ovx+EstO ? 1)，每天皮下注射0 ? 2ml Est芝麻油溶 液，剂量为〇. lmg/kg体重，N=15;
[0039] 第五组:卵巢切除+170-雌二醇(Ovx+Estl)，每天皮下注射0.2ml Est芝麻油溶液， 剂量为lmg/kg体重，N= 15。
[0040] 第一组和第二组动物每天皮下注射0.2ml芝麻油，作为对照;第三组至第五组动物 每天皮下注射不同剂量的雌二醇溶液。21天后，动物经股动脉放血处死，将子宫从阴道连接 处和双角分叉处剪断，迅速取出称重并用10%的多聚甲醛固定；同时取2-3个乳腺同样用 10%的多聚甲醛进行固定；同时从左心室抽取约0.6ml血液，离心后取血清，用放射免疫技 术测定血清性激素水平。将固定好的标本按常规方法进行石蜡包埋，子宫取横切面，乳腺取 纵切面，制备石蜡切片，进行HE染色，利用光学显微镜和图象分析系统对不同处理组动物子 宫和乳腺组织切片进行下列观察和测量：
[0041] 1)子宫观察和测量指标:选择双角子宫角腔完整的切片进行观察和分析，一个子 宫横切面上有两个角腔；
[0042]①以完整的角腔为单位，在10倍光镜下对其内膜上的腺体和血管总数进行计数； 同时在40倍光镜下在内膜区随机选5个视野，对每个视野中腺体的数量进行计数；
[0043]②在40倍光镜下对腺体及其上皮细胞的发育情况进行观察，同时随机选5个腺 体，利用图象分析系统测量腺体上皮细胞的高度，取平均值；
[0044]③利用光学显微镜上的标尺，随机选择5个视野，在10倍镜下对子宫内膜的厚度进 行测量，同时利用图象分析系统同样测量5个采集区子宫内膜的厚度，取平均值。可对两种 方法测得的结果进行比较；
[0045]④在40倍光镜下对子宫内膜上皮细胞的发育情况进行观察，并利用图象分析系统 测量5个随机采集区子宫内膜上皮细胞的高度，取平均值。
[0046] 2)乳腺观察:分别在低倍和高倍镜下，同时结合图象分析系统，对不同处理组动物 的乳腺腺泡及乳腺导管的发育情况进行观察。
[0047] 3)血管通透性检测
[0048] ①对卵巢切除大鼠子宫炎性细胞渗出的影响
[0049] 取子宫用4%的多聚甲醛溶液进行固定，常规脱水后石蜡包埋，切片，进行HE染色， 高倍镜下(400倍)观察每张切片任意5个视野，数出嗜酸性粒细胞个数并求出平均值和标准 差，做出柱形图比较各组间差异。
[0050] ②对卵巢切除大鼠视网膜中EB渗出的影响
[0051]实验动物造模完成后，按实验大鼠用规格为2ml: 0. lg盐酸氯胺酮溶液按0.3ml ? kg<体重-0.5ml ? kg<体重进行腹腔注射麻醉后剪开胸腔，把1%的伊文思蓝溶液按2mg ? kg^1体重经左心室注入，循环5min后用1 %的多聚甲醛溶液按60ml ? mirT1体重固定2min，再 用37°C预热的生理盐水120ml进行冲洗约5min，同时剪开右心耳，迅速摘取大鼠眼球，分离 视网膜，称重记录;将视网膜置于300yl甲酰胺溶液中，在70°C下孵育18h，然后在4°C下以 7500r/min高速离心8min，取上清液50yl，用蒸馏水定容至3ml后，用分光光度计在620nm处 测定吸光度值并记录;根据视网膜孵化液在620nm处的吸光值、标准曲线方程和视网膜湿重 算出视网膜中伊文思蓝的含量(ng ? g-1组织）。
[0052] 2.2数据处理
[0053] 结果均以f ±沒表示。统计学处理两组间用t检验，多组间用方差分析(AN0VA)，P〈 〇.〇5具有显著性差异。
[0054] 3 结果
[0055] 3.1外源给雌二醇对卵巢切除大鼠血清性激素水平的影响
[0056] 卵巢切除后21天实验大鼠血清雌二醇水平明显下降，皮下注射不同剂量外源性雌 激素，血清雌激素水平明显升高，其中注射雌激素(〇.lmg/Kg)可使血清雌二醇接近正常水 平(见表3.1-1)。
[0057]表3.1-1雌激素对卵巢切除大鼠血清Est(pg/ml)的影响
[0059 ]与 Sham 组相比 **P〈0 ? 01;与Ovx组相比+P〈0 ? 05，++P〈0 ? 01，+++P〈0 ? 001 (Mean 土 SD，n = 5~6) 〇
[0060] 3.2子宫增生情况
[0061] 3.2.1雌二醇对卵巢切除大鼠子宫重量和子宫系数的影响
[0062] 大鼠卵巢切除后21天，Ovx组子宫重量及子宫系数降低，外源给雌二醇后，大鼠的 子宫重量和子宫系数增加，且呈雌激素剂量依赖效应，且雌二醇〇. lmg/kg给药时，卵巢切除 大鼠的子宫重量和子宫系数就可以恢复到正常水平，与动情期假手术大鼠相似(见表3.2- 1).
[0063]表3.2-1雌激素对卵巢切除大鼠子宫重量和子宫系数的影响
[0065] 与Sham组相比：***P<0 ? 001;与Ovx组相比：++P<0 ? 01，+++P<0 ? 001
[0066] 3.2.2雌二醇诱发去卵巢大鼠子宫形态结构的变化
[0067] 大鼠卵巢摘除后子宫萎缩明显，子宫内膜、肌层均变薄。给予外源性雌二醇 (O.Olmkg-1体重、O.lmg kg-1体重、l.Omg ? kg-1体重)后，子宫内膜厚度增高，肌层增厚、腺上 皮细胞高度增高、肌细胞直径增大，被覆上皮细胞高度增加，且与外源雌二醇给药剂量呈剂 量依赖关系，其中雌激素〇.lmg/kg给药后，卵巢切除的大鼠的子宫各项指标可达到或稍超 过假手术大鼠水平，而雌激素 lmg/kg体重给药后，卵巢切除大鼠的子宫各项指标都明显高 于正常，呈现异常增生状态(见图1A-E)。
[0068]大鼠切除卵巢后21天，取其子宫作石蜡切片，HE染色，经光学显微镜和图象分析系 统观察分析，发现卵巢切除后，大鼠子宫壁明显变薄，无论是通过显微镜目测或利用图象分 析系统测定结果显示其内膜厚度明显变小，内膜被覆上皮细胞明显变矮;腺体萎缩，腺体数 量减少，腺上皮细胞明显变矮。皮下注射Est(lmg/kg)后，卵巢切除大鼠子宫内膜明显增厚， 腺上皮细胞和内膜被覆上皮细胞明显增大，基本可恢复甚至超过假手术大鼠的水平，内膜 被覆上皮细胞不但增高且多出现假复层上皮，但子宫腺体的数量无明显增多（见图2)。
[0069] 3.3乳腺增生情况
[0070] 大鼠乳腺由结缔组织、腺泡和导管组成，腺泡和导管的上皮细胞由单层立方或低 柱状上皮细胞组成，有些大导管从单层柱状上皮逐渐变为复层柱状上皮。大鼠卵巢切除21 天后，乳腺明显萎缩，腺泡减少，导管减少变小。卵巢切除大鼠皮下注射Est(0.01、0.1和 lmg/kg体重)后，乳腺腺泡和导管及其上皮细胞有不同程度的增生，乳腺组织密度增加明显 (见图3)。
[0071] 3.4血管渗出的影响
[0072] 3.4.1对卵巢切除大鼠子宫炎性细胞渗出的影响
[0073] 大鼠摘除卵巢后21天，大鼠子宫萎缩明显，子宫内膜中嗜酸性粒细胞渗出减少。给 予外源雌激素后嗜酸性粒细胞渗出增加。与Sham组比较，Ovx组未出现嗜酸性粒细胞渗出； 当给予外源性的不同剂量的雌二醇(〇.〇lmg.kg-l体重、0. lmg.kg-1体重和lmg.kg-1体重） 处理后可诱导嗜酸性粒细胞的渗出（图4-1、图4-2)
[0074] 3.4.2雌激素对卵巢切除大鼠视网膜中EB渗出的影响
[0075]大鼠卵巢切除后21天，大鼠视网膜EB渗出明显减少；给外源雌激素0. lmg/kg和 lmg/kg后，视网膜中EB渗出明显增加。
[0076] 表3.4-1不同剂量170-雌二醇卵巢切除大鼠视网膜中EB渗出的影响
[0079]注：与Sham组相比：▲表示P〈0 ? 05;与Ovx组相比：*P〈0 ? 05，#P〈0 ? 001。
[0080] 4、实验结论
[0081 ]⑴卵巢切除大鼠的体内血清雌二醇水平明显下降，外源皮下注射雌二醇后，卵巢 切除大鼠体内雌二醇水平升高，与外源雌二醇给药剂量呈剂量依赖效应，且外源给予雌二 醇O.lmg/kg体重时，卵巢切除大鼠体内雌二醇水平可达到动情期大鼠的血清水平。
[0082] ⑵大鼠卵巢摘除后子宫萎缩明显，子宫内膜、肌层均变薄。给予外源性雌二醇后， 子宫内膜厚度增高，肌层增厚、腺上皮细胞高度增高、肌细胞直径变长，被覆上皮细胞高度 增加，且与外源雌激素给药剂量呈剂量依赖关系，其中雌激素〇. lmg/kg给药后，卵巢切除的 大鼠的子宫各项指标都恢复到正常水平，而雌激素lmg/kg给药后，卵巢切除大鼠的子宫各 项指标都高于正常值，现异常增生状态(P〈〇. 〇〇1)。
[0083] ⑶大鼠卵巢切除21天后，乳腺明显萎缩，腺泡减少，导管减少变小。卵巢切除大鼠 皮下注射Est(lmg/kg)后，乳腺腺泡和导管及其上皮细胞有不同程度的增生，乳腺组织密度 增加明显。
[0084] ⑷大鼠摘除卵巢后21天，大鼠子宫萎缩明显，子宫内膜中嗜酸性粒细胞渗出减少， 给予外源雌二醇后嗜酸性粒细胞渗出增加 (p〈〇.001);大鼠卵巢切除后21天，大鼠视网膜EB 渗出明显减少;给外源雌二醇后，视网膜中EB渗出明显增加 (p〈0.05)。
[0085] 综上所述，与卵巢切除大鼠相比，以本发明的子宫和乳腺异常增生及血管通透性 提高大鼠模型的造模方法制作的大鼠模型在子宫体重、子宫形态、乳腺形态、血管通透性 水平与对照方面均具有显著性差异；与正常大鼠相比，外源雌二醇(〇.lmg/kg体重）可恢复 去卵巢大鼠血清的雌二醇水平，而外源雌二醇（lmg/kg体重)则可造成大鼠的子宫和乳腺异 常增生及血管通透性提高。由此可见本发明的一种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高 大鼠模型的造模方法是成功的，可以用于科学研究。
【主权项】
1. 一种子宫和乳腺异常增生及血管通透性提高大鼠模型造模方法，其特征在于，具体 包括以下步骤： ⑴将50-55日龄的清洁级雌性Wistar大鼠，随机分成5组，每组15只，同组放入一笼中，5 组大鼠均在室内温度25 °C、相对湿度54 %的饲养室饲养7天； ⑵在无菌条件下，选4组大鼠进行卵巢切除术，剩余组进行假手术;卵巢切除术具体是 先用盐酸氯胺酮80mg/kg腹腔注射麻醉，再沿着背部脊柱两侧切口，单侧切口距脊柱lcm、距 最后肋骨1.5cm，切口长1.5-2cm，切开皮肤和肌肉层后放入定高切口保护器扩张肌肉层，所 述定高切口保护器通道直径1.5cm，找到卵巢，近端输卵管上做两个结扎，将卵巢切除 (Ovx)，滴数滴青霉素注射液以防止感染，逐层缝合创口，术后用无菌〇.9%NaCl注射液配置 青霉素注射液0.8万U/ml，每只大鼠lml腹腔注射，每天1次，连续注射3天，以防止腹腔感染， 术后原笼饲养； (3)恢复一周后，分别标记5组为:假手术(Sham)、卵巢切除(Ovx)、卵巢切除+17β-雌二醇 0 · 01mg/kg体重(Ovx+EstO · 01)、卵巢切除+17β-雌二醇0 · lmg/kg体重(Ovx+EstO · 1)、卵巢切 除+17β-雌二醇lmg/kg体重(Ovx+Estl);第一组和第二组大鼠每天皮下注射0.2ml芝麻油， 作为对照;第三组至第五组大鼠每天皮下注射不同剂量的17β_雌二醇芝麻油溶液； ⑷21天后，测定大鼠血清雌二醇水平、子宫重量及形态结构、乳腺形态的变化以确定其 增生情况，测定子宫内膜中嗜酸性粒细胞渗出量和大鼠视网膜ΕΒ渗出量的变化以确定其血 管通透性的变化情况，基于增生情况和血管通透性变化情况的结果综合判定模型成功度。
【文档编号】A01K67/027GK105850890SQ201610176756
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月25日
【发明人】李红芳, 邱小青, 豆兴成, 金珊, 汪龙德
【申请人】李红芳