专利名称：猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原，该病主要以患畜生长缓慢、进行性消瘦和多系统病例损伤为特征。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996 年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。随着我国养猪业受到PCV2感染的危害日益严峻，研制PCV2血清抗体检测试剂盒的临床需求迫切。 PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含两个大的开放阅读框架ORFl和0RF2， 分别编码病毒蛋白复制酶(Itep)和病毒衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白是病毒的主要结构蛋白， 含有4个抗原表位，具有较好的免疫原性和抗原性，是检测该病毒特异性抗体的理想靶抗原。由于该病毒在体外培养不产生细胞病变，病毒繁殖能力低，难于获得高产量的病毒抗原用于诊断目的。而昆虫杆状病毒表达系统以其表达外源蛋白产量高、免疫活性好、产物易纯化、反应背景低等优点，在多种动物疫病诊断中得到应用。检测PCV2的衣壳蛋白抗体可以反映PCV2的抗体水平，对猪群PCV2抗体水平进行监测，可确切了解猪体免疫水平或感染状况，制定最适免疫程序或淘汰选育，有效预防和控制PCV2的侵袭和传播，避免因此而引起的重大经济损失。目前，国内外采用的PCV2检测技术主要有病毒分离培养，间接免疫荧光，免疫酶单层实验(IMPA)，原位杂交(ISH)，聚合酶链式反应(PCR)等等。上述技术和方法虽然可以检测PCV2或抗体水平，在实践中也取得一定的效果。但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成品昂贵等缺点，不易在基层单位普及。中国专利公开号为 CN1584597A的专利申请公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体ELISA检测试剂盒。上述专利抗体检测试剂盒所用检测板包被的抗原为原核表达的蛋白，且二抗为羊抗猪多克隆抗体。本发明采用双单抗结合技术检测抗体，特异性更强，灵敏度更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2型(PCV2) ELISA抗体检测试剂盒，本发明采用单克隆抗体包被法间接包被基因工程抗原制备反应板，进而组成用间接酶联免疫吸附实验检测猪圆环病毒2型抗体的试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还弥补了由于抗原问题而导致的灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。本发明的技术方案为一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2_Cap)的酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，酶标板预先包被PCV2-cap蛋白单克隆抗体，包被缓冲液0. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔0. I-Iug ；封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被PCV2-cap蛋白，包被量为每孔0. I-Iug ；样品稀释液为含有质量浓度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0. 01-0. 05% NaN3 的O.Olmol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBQ ；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0. 05%吐温-20的0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的 PBS ；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为lmol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。辣根过氧化物酶标记的是小鼠抗猪IgG单克隆抗体。上述各种溶液的配制①样品稀释液0. 1-10 % BSA, 0. 01-0. 05 % NaN3的 0. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐温-20 (Tween-20)；③酶底物3，3，-5，5，-四甲基联苯胺(TMB)溶液:i)底物A 液称取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL纯化水，用乙酸调PH值为5. 0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度为95-98%浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。所述重组PCV2_Cap蛋白的制备方法为利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTA AGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2:5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 从 PCV2 基因组中扩增出 0RF2 基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体PFastBac-Dual中，构建0RF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),将该重组质粒转化大肠杆菌DHlOBac，获得重组bacmid，将重组l^acmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-0RF2 (2X)0将该重组杆状病毒感染 Sf9细胞，即可表达Cap蛋白，并且该蛋白可自我组装形成病毒样颗粒(VLPs)，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，即可获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。本发明还提供了猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其中所述抗原酶标板制备方法是先包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体，再结合纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)。
图1为本发明工艺流程图。图2为本发明检测原理示意图。图3为表达的PCV2_cap蛋白SDS-PAGE分析图。其中M是Marker，1是纯化的 PCV2-cap 蛋白。
具体实施例方式实施例一.猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法
1.获得PCV2-cap蛋白单克隆抗体PCV2-cap蛋白单克隆抗体抗体可商购，也可通过本领域常规方法制备，制备已知抗原的抗体的方法是本领域公知的；本发明中使用的 PCV2-cap 蛋白单克隆抗体购自 RuralTechnologies, Incorporated ；2.获得辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG酶结合物小鼠抗猪IgG单克隆抗体可商购，也可通过本领域常规方法制备；本发明中使用的小鼠抗猪IgG单克隆抗体购自洛阳赛尔维实验器材公司；然后用改良的过碘酸钠氧化法进行标记；最后酶标记物加入
牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的中性甘油，测定工作浓度后，-20°C保存备用；3.所述重组PCV2_Cap蛋白的制备方法为利用基因工程技术Bac-to-Bac系统构建表达PCV2-0RF2基因(Cap蛋白)的重组杆状病毒，根据PCV2的基因序列设计Cap特异性引物上游引物 1 :5，-TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTT TAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，以 PCR 从 PCV2 基因组中扩增出 0RF2 基因全序列，将其亚克隆至杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中，构建0RF2基因双拷贝的重组质粒pFastBac-Dual-0RF2 (2X),将该重组质粒转化大肠杆菌DHlOBac，获得重组bacmid， 将重组bacmid转染Sf9细胞，获得重组杆状病毒rBac-0RF2 (2X)0将该重组杆状病毒感染 Sf9细胞，即可表达Cap蛋白，并且该蛋白可自我组装形成病毒样颗粒，收集Cap蛋白，通过超速离心和CsCl密度梯度离心，即可获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白作为包被用抗原。4.将PCV2_cap单克隆抗体均勻的包被在酶标板孔上，包被缓冲液为0. 05M pH9. 6 的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03，包被量为每孔0. I-Iug ；封闭液为BSA或脱脂牛奶，浓度是1-10% ；封闭完再包被的是PCV2-cap蛋白，包被量为每孔 0.I-Iug ；5.试剂盒其他溶液配制①样品稀释液1% BSA，0.05% Ne^3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐温-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液i)底物A液称取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL纯化水，用乙酸调PH值为5. 0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度为95%浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。实施例二 .猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤1.将待检样本用样本稀释液100倍稀释，每孔加lOOul，同时加入阳性和阴性对照液，设空白对照。置37°C孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加酶标抗体100ul，37°C 孵育1小时；洗涤液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光显色5-10分钟，加入终止液，每孔50 μ 1。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A45tlnm.2.结果判定Cut Off(C0值)=阴性对照光吸收值A45tlnmX 2. 1倍，样品值=样品光吸收值A45cinmAX)值，样品值大于1判为阳性；样品值小于1和等于1判为阴性。实施例三实验结果及分析1.特异性检测用本发明制造的试剂盒分别检测猪PCV2灭活疫苗免疫血清，猪 PCV2感染血清、猪PCVl感染血清、猪蓝耳病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、猪PCV2阴性血清，操作和判定按照具体实施方式
中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，结果显示，猪PCV2免疫血清和感染血清检测为阳性，其他样品检测为阴性，特异性为100%。2.灵敏度检测用本发明制造的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清，操作和判定按照具体实施方式
中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，检测结果为最高检测到阳性参考样品的稀释度为1 800。3.与现有试剂盒的实验结果的比较实验用本发明制造的试剂盒与同类试剂盒同时检测猪PCV2免疫血清5份、猪PCV2抗体阴性血清和不同稀释度的PCV2抗体阳性参考血清。操作和判定按照具体实施方式
中猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒的操作步骤进行，检测结果显示本发明中的试剂盒检测灵敏度显著高于其他同类产品。(见下表)
检测样品试剂盒1试剂盒2试剂盒3本发明试剂合 JIO-检测板所包被抗原PCV2合成肽抗原原核表达的 PCV2-Cap 蛋白PCV2全病毒PCV2-Cap VLP颗粒检测样品稀释倍数1: 51: 101: 51: 100猪 PCV2 免疫血清10. 5990. 8900. 4211. 20120. 6020. 5990. 5011. 32130. 5780. 5670. 4871. 10340. 5590. 5440. 4911. 22150. 5010. 4890. 4231. 099PCV2抗体阳性参考血清1: 100. 6021. 2010. 4981. 8971: 1000. 3240. 5690. 1991. 2561: 5000. 1210. 3760. 0991. 2011: 10000. 0870. 1210. 0650. 998猪 PCV2 抗体阴性血清1: 1000. 0760. 0870. 1210. 099序列表<110>武汉中博生物股份有限公司<120>猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒<160>4<210>1<211>29<212>DNA
<213>人工序列<400>1tctggatcca tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgaagcttt aagggttaag tggggggtc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3tctctcgaga tgacgtatcc aaggaggcg 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4gcgggtacct aagggttaag tggggggtc 29
权利要求
1.一种猪圆环病毒2型(PCM)ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含有预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其中所述的核衣壳蛋白是纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。
2.权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述PCV2-Cap蛋白已自我组装形成病毒样颗粒，并通过CsCl密度梯度离心纯化获得。
3.权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于所述的PCV2-Cap蛋白通过如下方法制备提取猪圆环病毒2型基因组，通过特异性引物扩增PCV2-Cap基因片段，利用 Bac-to-Bac系统构建能表达PCV2_Cap基因的重组杆状病毒，将所述重组杆状病毒感染Sf9 细胞，收获表达的Cap蛋白，通过CsCl密度梯度离心纯化后作为包被用PCV2-Cap蛋白抗原。
4.权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于所述的特异性引物是上游引物1:5’ -TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，，下游引物 1 :5，-GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3，，上游引物 2 :5，-TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG-3，下游引物 2 :5，-GCGGGTACCTAAGG GTTAAGTGGGGGGTC-3’。
5.权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于酶标板预先包被PCV2-cap蛋白单克隆抗体，包被缓冲液是0. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔0. I-Iug ；封闭液为质量浓度是的牛血清白蛋白BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被纯化的PCV2-Cap蛋白，包被量为每孔0. I-Iug ；样品稀释液为含有质量浓度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0. 05% NaN3的O.Olmol/L及 PH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBQ ；酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)-小鼠抗猪IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0. 05%吐温-20的0. Olmol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液为3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液(TMB)，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为 lmol/L H2SO4 溶液。
6.权利要求1-4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包含阳性对照和阴性对照。
7.制备如权利要求1-4任一项所述的试剂盒的方法，其特征在于所述抗原酶标板制备方法是先包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体，再结合纯化的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)。
全文摘要
本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包被猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)单克隆抗体和猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap)的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其中所述的核衣壳蛋白是纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。本发明试剂盒的特异性达100％；灵敏度为1∶800。本试剂盒用于对猪群PCV2抗体水平进行监测，确切了解猪体免疫水平或感染状况。
文档编号G01N33/577GK102183650SQ20111003828
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者刘汉平, 廖园园, 朱薇, 熊媛媛, 靖志强 申请人:武汉中博生物股份有限公司