一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试剂盒与检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒耐药性和基因型的检测试 剂盒与检测方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，是引起急、慢性肝炎的主要病原之一，并可导致肝 硬化、肝功能衰竭和肝癌。我国是乙型肝炎的高发国家，2009年卫生部公报显示2008年乙 肝发病率为106. 54/10万人，发病人数为141万例。HBV感染威胁国民健康，HBV的及早诊 断和正确治疗应该受到极大关注。
[0003] 干扰素、拉米夫定、替比夫定、阿德福韦和即将上市的替诺福韦均为国内抗病毒的 一线药物，随着抗病毒治疗药物的广泛应用，同时HBV逆转录酶缺乏严格的校正机制，导致 HBV复制过程中核苷酸错配率较高，HBV重要位点的基因突变可导致氨基酸侧链的柔性减 低，并在HBV的DNA聚合酶和核苷类似物三磷酸盐之间形成空间位阻，与核苷类似物三磷酸 盐的结合力下降，从而导致核苷类似物抗病毒药物的耐药发生。目前已发现的HBV耐药变 异位点主要集中在P基因的Pol/RT区域，该区域由344个氨基酸编码序列组成，常见的耐 药突变类型包括 rtL180M、rtA181T、rtA181V、rtM204I、rtM204V 和 rtN236T 等。干扰素的 治疗与1896G - A位点突变有关，但是1896位点突变是否发生干扰素耐药，目前还存在一 定争议。
[0004] 同一病毒核苷酸序列的差异，表现为HBV不同的基因型。迄今为止，根据HBV全基 因核苷酸序列的异质性彡8 %或S区基因序列差异彡4%，将HBV分为A~Η八种基因型。 在我国内地主要流行B、C和D3种HBV基因型，所占比例分别为32. 06%、67. 38%和0. 56%。 HBV导致的肝癌中，B基因型比C基因型发生单一肿瘤者多，同时伴随更多的卫星病灶，HBV/ C基因型携带者大多有慢性肝病，HBV/D基因型感染者多无症状且HBeAg血清转换较早。
[0005] 近年来，HBV耐药性问题日趋严重，对其耐药性检测在乙型肝炎的治疗中有着举足 轻重的作用。同时对HBV感染者进行基因分型检测，明确其基因型，进一步揭示基因型与病 情进展与转归的关系，可为临床医生提供更明确的病因诊断，从而拟定抗病毒治疗方案。对 乙型肝炎病毒的分型情况和与用药相关情况进行定性检测，以辅助临床诊断，也可用于流 行病学调查等领域。寻找一种简便、快速、准确的检测耐药和分型的方法成为许多乙肝科研 工作者的重大课题，也是临床实践检验中急待解决的问题。
[0006] 目前用于HBV耐药和分型的分子检测方法主要有：测序法、限制性片段长度多态 性分析法（RFLP)、实时荧光定量PCR方法、线性探针反向杂交法、PCR-基因芯片法等。⑴ 测序法是HBV基因检测的金标准，准确率高，但灵敏度较低、混合基因型检测能力差（需要 筛选大量克隆），需要测序仪及昂贵的试剂，不适用于临床检测；⑵RFLP方法不需要复杂设 备、试剂，但目前方法标准化程度差；⑶定量PCR方法灵敏度高，但通量低，难以检测多基因 位点变异；⑷线性探针反向杂交法（INNO-LiPA)扩展性差、肉眼判读容易误判，检测成本高 (进口商业试剂盒），难以在国内临床实验室常规开展。
[0007] 目前临床需要高通量、高特异性、操作简单，结果判断能自动化的检测方法，因此， 研发快速灵敏的乙肝实验室耐药和分型检测技术，存在着巨大的市场需求。基于基因检测 的生物芯片技术是近几年发展起来的进行大规模遗传多态性位点检测的新方法，是物理 学、微电子学与生命科学等学科的交叉结合，该技术以其分析速度快、可多指标并行检测、 所需试剂及样品量少等优势适应了这一需要，为解决这些问题提供了新的科技手段。
[0008] 基因芯片的原理是将多种探针固定在基片上，然后与待测样本的DNA或RNA进行 杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。由于该 法同时将大量探针固定于支持物上，所以一次可以对大量样品进行检测和分析。针对乙肝 耐药和分型检测，可以利用芯片技术，将目前已明确的耐药突变探针和分型探针全部固定 到一张芯片上，只需一次杂交，即可获得某一样品的多位点、多药物的耐药检测结果和分型 结果。目前用基因芯片检测HBV耐拉米夫定基因突变已取得一定成果。结果表明方法准确、 快速，特异性高，信息量大，成本较低，可准确地确定突变类型和分型信息，具有明确的应用 价值。
[0009] 在检测突变和SNP，尤其是临床相关的检测时，非常关注提1?芯片检测的灵敏度和 特异性。实现这一目标的主要障碍在于，由于标记的靶标核酸与固定于芯片表面的寡核苷 酸探针之间的杂交反应是影响芯片检测关键因素，作为双链的DNA只有一条链能够与固定 于芯片表面的探针进行杂交反应，另外一条链因竞争而充当了该杂交反应的干扰因素。因 此，制备单链DNA的不对称PCR反应非常必要。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供一种用于检测乙型肝炎病毒的7种突变型和3种基因型 的试剂盒。
[0011] 上述所述的试剂盒包括如下三组引物：
[0012] (1)用于检测乙型肝炎病毒6种突变型的第一组引物，包括：
[0013] 所述乙型肝炎病毒6种突变型为180M型、181T型、181V型、204I-ATC型、204V型 和236T型；
[0014] a、用于检测180M型的引物为：SEQ ID N0. 4中第23-42位核苷酸分子所示的正向 引物和用于与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0015] b、用于检测181T型的引物为：SEQ ID N0. 5中第22-41位核苷酸分子所示的和SEQ ID N0. 8中第22-42位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的 引物；
[0016] c、用于检测181V型的引物为：SEQ ID N0. 3中第23-42位核苷酸分子所示的正向 引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0017] d、用于检测204I-ATC型的引物为：SEQ ID NO. 1中第24-47位核苷酸分子所示和 SEQ ID N0. 6中第24-47位核苷酸分子所示的正向引物，与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所 示的引物；
[0018] e、用于检测204V型的引物为：SEQ ID N0. 2中第23-45位核苷酸分子所示的正向 引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0019] f、用于检测236T型的引物为：SEQ ID NO. 7中第23-48位核苷酸分子所示的正向 引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0020] (2)用于检测乙型肝炎病毒的3种基因型的第二组引物，包括：
[0021] 所述乙型肝炎病毒的3种基因型为HBV/B型、HBV/C型和HBV/D型；
[0022] g、用于检测HBV/B型的引物为：SEQ ID N0. 13中第22-44位核苷酸分子所示的正 向引物，与正向引物配对的SEQ ID N0. 17所示的和SEQ ID N0. 18所示的引物；
[0023] h、用于检测HBV/C型的引物为：SEQ ID N0. 15中第21-39位核苷酸分子所示的正 向引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 19所示的引物；
[0024] i、用于检测HBV/D型的引物为：SEQ ID N0. 16中第21-39位核苷酸分子所示的正 向引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 20所示的引物；
[0025] (3)用于检测乙型肝炎病毒的1896A型和204I-ATT型的第三组引物，包括：
[0026] j、用于检测1896A型的引物为：SEQ ID N0. 22中第25-43位核苷酸分子所示的正 向引物，与正向引物配对的SEQ ID N0. 24所示的、SEQ ID N0. 25所示的和SEQ ID N0. 26所 示的引物；
[0027] k、用于检测204I-ATT型的引物为：SEQ ID N0. 21中第24-42位核苷酸分子所示 的正向引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 27所示的引物。
[0028] 上述试剂盒中，所述的正向引物序列的5'端均连接有标签序列，每种突变型和基 因型所对应的标签序列各不相同；各标签序列为与引物扩增模板序列不配对的寡核苷酸序 列。
[0029] 上述试剂盒中，所述与正向引物配对的引物标记有荧光素，具体是在与正向引物 配对的引物5'端标记有荧光素；所述荧光素具体为四甲基罗丹明荧光素。
[0030] 上述试剂盒中，所述的引物如下：
[0031] 用于检测180M型的引物为：SEQ ID N0. 4所示的正向引物和用于与正向引物配对 的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0032] 用于检测181T型的引物为：SEQ ID N0. 5所示的正向引物、SEQ ID N0. 8所示的正 向引物和与正向引物配对的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0033] 用于检测181V型的引物为：SEQ ID N0. 3所示的正向引物和用于与正向引物配对 的SEQ ID N0. 9所示的引物；
[0034] 用于检测204I-ATC型的引物为：SEQ ID NO. 1所示的正向引物、SEQ ID N0. 6所示 的正向引物和与正向引物配对的SEQ ID NO.