乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物忍片和诊断试剂技术领域，设及一种针对乙型肝炎病毒八种基因 亚型的鉴别检测方法及引物和探针，具体是一种采用基于微球的液相忍片技术用于快速对 乙型肝炎病毒八种基因亚型进行检测的方法。
【背景技术】
[0002] 乙型病毒性肝炎是长期困扰全球医学界的难题，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重 要致病因子之一，也是全世界最严重的公共卫生问题之一。据WT0报告，全球60多亿人 口中，有大约30亿人口生活在乙型肝炎病毒（皿V)高流行地区，超过20亿人感染过皿V， 其中慢性感染者超过3. 5亿。我国每年的乙肝发病率在6000万人次W上，是一个乙型病毒 性肝炎发病大国。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50%的肝硬化和70 - 90%的 肝癌，是由慢性皿V感染引起，而感染了皿V变异体的皿V携带者有7 - 30%。
[000引 目前根据基因序列的核巧酸差异将皿V分为A~Η8种基因型别，按照全基因序 列核巧酸差异> 8%或其S基因序列核巧酸差异> 4%的差异度判定为不同型别，同一基因 型满足序列差异《5. 6%。近年来的研究表明由基因突变导致的不同的皿V基因型，呈地理 区域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐 药、预后有密切的关系。因此，通过有效而准确的检测方法对皿V进行早期的检测与分型， 对皿V的早期治疗和术后检查具有重要的意义。
[0004]目前乙型肝炎病毒基因分型的检测方法包括基因序列测定、聚合酶链反应-限制 性片段长度多态性分析（PCR-R化Ρ)、基因型特异性多引物对PCR分型（即巢式PCR法)、特 异性线性探针检测法（INN〇-LiPA)、PCR微板核酸分子杂交化ISA法、单克隆抗体ELISA法 W及基因忍片。但运些方法或多或少存在一些缺陷：如基因测序分型方法虽然结果准确可 靠，但过程繁琐、费时、成本高、难W推广，不适合大样本的检测，且缺乏敏感性，不能发现同 一个体中两种或两种W上的皿V基因型的混合感染。PCR-RFLP对于单个核巧酸位点的多态 性所导致的限制性内切酶酶切位点改变有碍内切酶消化，酶切不完全会出现复杂的条带， 酶切图谱识别复杂，因而影响基因分型的可信度，且该法同样不能发现几种基因型的混合 感染。巢式PCR法方法需要合成多条引物，需经两轮PCR过程，较RFLP法历时长，污染机会 较大，且无法完全避免出现非特异性扩增条带而妨碍观察分型结果。INNO-LiPA存在价格昂 贵、特异性稍低的不足。单克隆抗体ELISA法不能对血清皿sAg阴性的皿V感染进行基因 分型，W及少数皿sAg无法分型。基因忍片存在成本较高、假阳性率高、不同忍片的集成度 不足等缺点。PCR微板核酸分子杂交化ISA法适用于自动化程度较高的实验室。
[0005] 对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设W多重快速 检测为目标的检测平台。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方 法及试剂盒，其利用多重聚合酶链反应（PCR)结合液相忍片来快速定性和定量检测八种乙 型肝炎病毒基因亚型，特异性和灵敏度高、重复性好。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测下列乙型 肝炎病毒基因亚型的探针： 乙型肝炎病毒A基因型的探针皿V-A-P，乙型肝炎病毒B基因型的探针皿V-B-P，乙型 肝炎病毒C基因型的探针皿V-C-P，乙型肝炎病毒D基因型的探针皿V-D-P，乙型肝炎病毒E 基因型的探针皿V-E-P，乙型肝炎病毒F基因型的探针皿V-F-P，乙型肝炎病毒G基因型的 探针皿V-G-P，乙型肝炎病毒Η基因型的探针皿V-H-P，上述探针的核酸序列分别依次参见 沈QIDNO: 1-8,具体参见表1。
[000引表1乙型肝炎病毒A~Η基因型鉴别检测用探针
上述的探针中，皿V-A-P的检测位点位于乙型肝炎病毒A基因型全序列的2143-2162碱基，皿V-B-P的检测位点位于乙型肝炎病毒B基因型全序列的320-338碱基，皿V-C-P的 检测位点位于乙型肝炎病毒C基因型全序列的2985-3998碱基，皿V-D-P的检测位点位于 乙型肝炎病毒D基因型全序列的2521-2536碱基，皿V-E-P的检测位点位于乙型肝炎病毒E 基因型全序列的106-123碱基，皿V-F-P的检测位点位于乙型肝炎病毒F基因型全序列的 931-814碱基，皿V-G-P的检测位点位于乙型肝炎病毒G基因型全序列的1014-1029碱基， 皿V-H-P的检测位点位于乙型肝炎病毒Η基因型全序列的490-508碱基，其对应的标准序列 在基因库可查。
[0009] 所述试剂盒还包括用于扩增下列乙型肝炎病毒基因亚型目的片段的PCR引物对： 乙型肝炎病毒A基因型的引物对皿V-A-F和皿V-A-R，其序列分别为SEQ IDΝο:9和SEQ IDNo:10 ;乙型肝炎病毒Β基因型的引物对皿V-B-F和皿V-B-R，其序列分别为SEQ IDNo: 11和SEQ IDNo:12;乙型肝炎病毒C基因型的引物对皿V-C-F和皿V-D-R，其序列分别为 沈9 10齡：13和沈9 10齡：14;乙型肝炎病毒0基因型的引物对皿￥-0斗和皿￥-0-私其 序列分别为SEQ IDNo:15和SEQ IDNo:16;乙型肝炎病毒E基因型的引物对皿V-E-F和 皿V-E-R，其序列分别为SEQIDNo:17和SEQIDNo:18;乙型肝炎病毒F基因型的引物对 皿￥斗斗和皿￥斗-私其序列分别为沈9 10齡：19和沈9 10齡：20;乙型肝炎病毒0基因 型的引物对皿￥-6斗和皿￥-6-私其序列分别为沈〇10齡：21和沈〇10齡：22;乙型肝炎 病毒Η基因型的引物对皿V-H-F和皿V-H-R，其序列分别为沈QIDNo:23和沈QIDNo: 24。具体参见表2。
[0010] 表2乙型肝炎病毒A~Η基因型的引物对
每对引物对中下游引物的5'端修饰有生物素标记，每个探针5'端均带有胺基化修饰 且连有C12邻接臂序列、并分别与相应巧光标记的微球偶联。
[0011] 本发明还提供了一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的非疾病诊断的鉴别检测方法， 基于微球的液相忍片技术，包括W下步骤： ① 合成权利要求1和2所述的探针和引物对，将每对引物中的下游引物5'端进行生物 素标记；将每个探针5'端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列； ② 将所述探针分别与相应巧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性 核酸探针的微球组； ③ 抽提待测样本的DNA，采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； ④ 将PCR扩增产物与微球组溫育杂交，然后加入链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获 的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-阳的复合物，利 用液相忍片系统对待测样品进行定性和定量分析。
[0012] 采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1)本发明选用的引物对各自扩增的病 毒特异序列都有很高的灵敏度，在进一步改进的方案中，采用不对称PCR的方法，增加生物 标记单链的产量，提高后期PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球杂交结合的效率，提 高了检测的灵敏度；（2)本发明探针碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物 的杂交溫度条件基本一致，有利于同一溫度下杂交的同步性，提高检测的准确性；（3)本发 明利用多重PCR反应结合液相忍片，在一次试验中可W鉴别包括乙型肝炎病毒的A~Η八种 基因亚型，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的 优点。
【具体实施方式】
[0013] 一、按照表1和表2中的核酸序列合成所需的引物对和探针，将每对引物中的下游 引物5'端进行生物素标记；并将每个探针5'端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列。
[0014] 二、将所述探针分别与相应巧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特 异性核酸探针的微球组。
[0015] 选取编号为22、39、18、30、36、42、45、49共8种微球（ΒioRad公司），按照如下方法 进行核酸探针的偶联： I. 将储存于2-10°C的编号为22、39、18、30、36、42、45、49的8种微球及储存于-20°C的2瓶未开封EDC粉末（lOmg/瓶）置于室溫平衡30分钟-60分钟。
[0016]2.将皿V-A-P、皿V-B-P、皿V-C-P、皿V-D-P、皿V-E-P、皿V-F-P、皿V-G-P、皿V-H-P 核酸探针分别用(1地2〇溶解，浓度分别为0. 1nmol/μL; 3. 将8种微球分别高速縱满振荡30秒，再超声振荡30秒； 4. 各取100μΙ(1. 25Χ106个）微球分别加入8个1. 5血邱pendorf·管中； 5. 14000g离屯、4分钟沉淀微球； 6. 小屯、弃上清液，加入8. 5μL0. 1MMES(pH4. 5)重悬微球，并振荡混匀； 7. 每种核酸探针各取1μL(0. 1nmol/μL)分别加入上述对应编码的化pendo计管 中，并振荡混匀； 8. 新鲜制备lOmg/ml浓度的邸C溶液，向上述化pendo计管中每管加入0. 5μ1邸C溶液，并立即振荡混