1型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及1型鸭甲肝病毒化qMan巧光定量RT-PCR 检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的一种重要传染病，其主要致病因子是小RNA病毒， 即小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲型肝炎病毒（化ckh巧atitisAvi;rus，DHAV)。根据 全基因组序列分析，鸭甲型肝炎病毒可分为3个独立的基因型，基因A型鸭甲型肝炎病毒 值HAV-A)、基因B型鸭甲型肝炎病毒值HAV-B)和基因C型鸭甲型肝炎病毒值HAV-C);根据 血清学中和实验，运3个基因型无血清交叉，故分别对应3个不同的血清型，血清1型鸭甲 肝病毒值HAV-1)、血清2型鸭甲肝病毒值HAV-2)和血清3型鸭甲肝病毒值HAV-3)。其中， DHAV-A代表传统的流行毒株，全国范围内广泛流行，也是我国鸭甲肝病毒的主要流行毒株， DHAV-B代表台湾新型病毒株，DHAV-C代表近年来我国和韩国等国家和地区新出现的毒株。 由于3个基因型病毒所引起的疾病在临床症状、病理变化上较为相似，给鉴别带来很大困 难，而大陆主要流行DHAV-1型，所W对于DHAV-1的快速准确检测对于鸭病毒性肝炎的预防 与控制具有重要意义。
[000引目前关于DHAV的检测方法，国内外报道较多的包括血清中和试验、琼脂扩散试验 和化ISA等，运些传统检测方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用 中具有一定的局限性，在临床上常常因为不能对其及时做出正确的诊断和有效防制而造成 巨大的经济损失。而实时巧光定量RT-PCR技术凭借其操作简单、结果直观、敏感性高、特异 性强、重复性好及病原定量等优势，近年来在动物疫病检测中得W广泛应用。因此建立和优 化巧光定量RT-PCR方法，不仅为确定鸭病毒性肝炎致病因素提供了一种鉴别检测方法，同 时也为DHAV-1的流行病学调查提供了一种重要技术手段。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敏感性好、特异性高、准确可靠、快速简便 的检测DHAV-1的一步法巧光定量RT-PCR试剂盒及方法，所述方法利用化qMan探针技术， 能对DHAV-1的核酸进行准确定量检测。
[0005] 本发明采取的技术方案如下：
[000引1. 1型鸭甲肝病毒化qMan巧光定量RT-PCR检测引物对、探针，所述引物对由核巧 酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO. 2所示的下游引物组成， 所述探针的核巧酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 2.含有所述1型鸭甲肝病毒化qMan巧光定量RT-PCR检测引物对、探针的试剂盒。
[0008] 优选的，所述试剂盒反应液按总体积20 μ L计，由W下组分组成：2XoneSt巧 RT-PCR BufferIII10yL，RT Enzyme MixIlO. 4yL，EXTaq服DM聚合酶0. 4yL，20pmol/ μL的上、下游引物各0. 4μL，lOpmol/μL的探针0. 8μL，DHAV-IRNA模板2μL，最后用 RNaseRree地2〇 补至 20yL。
[0009] 优选的，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，所述阳性对照为DHAV-1的RNA， 所述阴性对照为健康鸭肝脏RNA、健康鸭胚尿囊液及胚体RNA。
[0010] 3.利用所述试剂盒检测1型鸭甲肝病毒的方法，巧光定量RT-PCR的反应条件为 42°C5min, 95°C10s( 一个循环）；95°C5s，54°C15s，反应进行45个循环，于54°C进行巧光 信号采集；用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，若出现Ct<35且呈对数增 长的特异性扩增曲线，则说明样品中含有1型鸭甲肝病毒；若未出现Ct<35且呈对数增长的 特异性扩增曲线，则说明样品中不含有1型鸭甲肝病毒。
[0011] 本发明的有益效果在于：采用本发明所述试剂盒可用于广泛检测1型鸭甲肝病 毒，检测时间短，检测成本低，重复性好，灵敏度高；本发明检测的祀点具有单一特异性，提 供的引物对和探针对不含目的基因的样品，均无扩增信号，具有良好的特异性；另外，引物 对和探针检测RNA灵敏度可达49copies/μ以具有良好的灵敏度。
【附图说明】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0013] 图1DHAV-1检测的定量标准曲线，Υ= -3. 367Χ+42. 688，R2= 1. 000,扩增效率为 98. 1%，表明误差小，可f目度局。
[0014] 图2DHAV-1检测的特异性试验结果，曲线1、2、3为DHAV-1特异性扩增曲线，其它 曲线为表2所述鸭攝病毒、禽流感病毒等病原体核酸及阴性对照（健康鸭肝脏RNA、健康鸭 胚尿囊液及胚体RNA)与空白对照的扩增曲线。
[0015] 图3DHAV-1标准品检测重复性验证结果，曲线1~10的拷贝数分别为 4. 88X1〇1°~4. 88X10icopies/μL结果显示该检测方法重复性好。
[0016] 图4敏感性试验结果，曲线1~4分别是底物浓度为4. 88Χ104~ 4. 88XIQicopies/μL的标准品扩增曲线，根据扩增曲线可看出该方法最低检测灵敏度为 49copies/μL。
【具体实施方式】
[0017] 下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018] 实施例1检测1型鸭甲型肝炎病毒的巧光定量RT-PCR检测试剂盒
[0019]根据DHAV-1核巧酸序列（登录号JQ301467. 1)，通过NCBI及MEGA5. 2进行序列比 对，利用Prime巧.0进行引物和探针设计，引物与探针均由上海基康生物技术有限公司合 成，引物和探针序列如下：
[0020] 定量探针及配套引物：
[0021] 上游引物F2 值HAV-1-F2) :5, -ccatctgtgtcattgtgttaggca-3'(沈QIDNO. 1)，
[0022] 下游引物R2 值HAV-l-R2) ;5，-caaatcagtttcaaggagttctcca-3'(沈QIDNO. 2)，
[0023]探针序列值HAV-1-肥讶为：5，-肥X-accgacatggcaatggaacctcca-B册-3,（沈QID NO. 3),
[0024] t不准品引物：
[00巧]上游引物F1值HAV-1-F1) :5, -ttaggtttatcagatgtggcttcc-3'(沈Q ID NO. , 4)，
[0026]下游引物R1值HAV-1-Rl) ;5，-gtttgctgccccaggtcc-3'(沈Q ID NO. ?5)。
[0027] 所述1型鸭甲型肝炎病毒的巧光定量RT-PCR检测试剂盒包括：
[0028] (1)特异性引物DHAV-1-F2和DHAV-1-R2 ;
[0029] (2)特异性探针DHAV-1-HEX ;
[0030] 做巧光定量RT-PCR反应液组分（总体积为20μL) :2XonestepRT-PCR BufferIII10yL，RTEnzymeMixIlO. 4yL，EXTaq服DM聚合酶 0. 4yL，20pmol/yL 的上、下游引物各0. 4yL10pmol/yL的探针0. 8化，DHAV-IRNA模板2化，最后用RNase 化ee地2〇补至20μL;
[003。（4)阳性对照：接毒（DHAV-1)鸭胚，待24~4化鸭胚死亡收集尿囊液提取的 DHAV-1RNA；
[0032] (5)阴性对照：健康鸭肝脏RNA、健康鸭胚尿囊液及胚体提取的RNA。
[003引实施例2 1型鸭甲肝病毒巧光定量RT-PCR检测方法的建立
[0034] 1.材料
[0035]One Step PrimerScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time)、RNAiso Plus均购 自宝生物（大连有限公司）。
[0036] 2.方法与结果
[0037] 2. 1RNA标准品模板的制备
[0038] (l)VPO的克隆：运用宝生物RNAisoPlus按试剂盒说明书提取1型鸭甲肝病毒的 RNA，根据宝生物反转录试剂盒将病毒RNA转录为cDNA。应用标准品引物F1和R1，W体外 转录cDNA为模板进行普通PCR扩增，得到VP0目的片段。将目的片段与pGEM-T载体连接 构建重组质粒pGEM-T-VPO。