检测dhav-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物医学领域，具体涉及一种检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸及其制备方法。
【背景技术】
[0002]鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis)为主要由I型鸭甲肝病毒(Duckhepatitis A virus type I,DHAV-1)引起的雏鸭的一种急性、高度致病性传染病，发病急，传播迅速，病程短，死亡率高。临床表现角弓反张，剖检见肝脏肿大和大量的出血性斑点，是危害养鸭业的主要疾病之一。虽然我国研制的鸭肝炎鸡胚化弱毒疫苗和灭活苗，在全国应用推广，对种鸭、雏鸭进行免疫预防，取得很好的效果，然而，对DHAV-1特异性抗体的监测是评价DHAV-1弱毒疫苗和灭活苗免疫效果及制定合理免疫程序的关键，也是确认DHAV-1感染的手段之一。目前，用于DHAV-1抗体检测的方法主要有中和试验(neutralizat1ntest，NT)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、琼脂凝胶扩散试验、Dot-ELISA测定法、间接血凝及血凝抑制试验等。其中经典的方法是血清中和试验，但其敏感性不够理想，且耗时费力，不适于大批量血清样品的检测。ELISA具有特异性强、敏感度高、快速准确、易于操作等特点，是DHAV-1感染早期快速诊断和免疫抗体监测的有效手段，但检测过程耗时费力。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸，该试纸检测鸭甲型肝炎病毒抗体的特异性和灵敏性较高，且操作简单，耗时少，只需1min左右即可完成检测，另，本发明还提供了上述胶体金免疫层析试纸的制备方法。
[0004]本发明采取的技术方案如下:
[0005]1、检测I型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸，由底板、硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫和吸收垫组成，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度彡0.75mg/ml的I型鸭甲肝病毒的病毒液包被而成，质控线由浓度彡0.4mg/ml的A抗B IgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度彡0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成；所述A抗B IgG为免疫学研究中常规实验动物中除鸭外的任一种动物抗另一动物IgG。
[0006]优选的，所述硝酸纤维素膜上的测试线由浓度为0.75mg/ml的DHAV-1病毒液包被而成，质控线由浓度为0.4mg/ml的A抗B IgG包被而成；所述金标垫由胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白包被而成。
[0007]优选的，所述A抗B IgG为羊抗兔IgG。
[0008]2、检测I型鸭甲肝病毒抗体的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤:
[0009](I)硝酸纤维素膜上质控线和测试线的喷制:将I型鸭甲肝病毒的病毒液点于硝酸纤维素膜上形成测试线，将A抗B IgG包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，37°C干燥10?12h后密封保存；
[0010](2)金标垫的制备:将胶体金标记的浓度为0.25mg/ml的金标葡萄球菌A蛋白均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4°C冻干后密封保存；
[0011](3)试纸的组装:分别将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在底板上，硝酸纤维素膜上所述质控线一端靠近吸收垫，所述测试线一端靠近金标垫，切割成试纸条后，干燥密封低温保存。
[0012]优选的，所述步骤(I)中所述测试线和质控线之间的距离为0.6cm，测试线和质控线距硝酸纤维素膜边缘0.2cm。
[0013]优选的，所述步骤(2)中所述金标葡萄球菌A蛋白在进行胶体金标记时，最佳标记pH为每毫升金溶液加入6 μ I 0.025mmol/L 1(20)3溶液，最佳标记量为每毫升金溶液标记30 μ g金标葡萄球菌A蛋白。
[0014]本发明的有益效果在于:本发明通过将含有DHAV-1的尿囊液接种9?11日龄鸭胚，收集24h后死亡鸭胚尿囊液，并采用氯仿去脂、超速离心进行纯化并测定纯化后的DHAV-1浓度，进一步确定金标SPA工作浓度、优化羊抗兔IgG包被浓度、DHAV-1包被浓度等参数后，组装制备了胶体金免疫层析试纸。本试纸条具有以下优点:(1)敏感性高，将DHAV-1弱毒疫苗免疫鸭的阳性血清按体积稀释到32倍，也可以被本发明所述胶体金免疫层析试纸所检测；(2)运用该试纸检测非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭疫里默氏菌阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清、鸭甲型肝炎病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，结果显示只有I型鸭甲肝病毒阳性血清可见两条清晰的红色条带，呈阳性结果，而其他血清只在C线处可见一条红色条带，呈阴性结果，表明本试纸条具有很好的特异性；(3)应用本试纸检测DHAV-1抗体具有良好的批内和批间重复性；(4)本方法制备的试纸可在4°C或室温(25°C )保存数月；(5)应用该试纸检测鸭甲型肝炎病毒抗体的操作简单，耗时少，只需1min左右。
【附图说明】
[0015]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0016]图1为胶体金免疫层析试纸条的组装示意图。
[0017]图2为胶体金免疫层析试纸条的结果判定示意图。
[0018]图3为试纸条的条件优化结果，其中，A图为纯化的DHAV-1在NC膜上包被浓度优化结果图为羊抗兔IgG在NC膜上包被浓度优化结果；C图为胶体金标记的SPA稀释度优化结果。
[0019]图4为所述胶体金免疫层析试纸条的灵敏度试验结果。
[0020]图5为所述胶体金免疫层析试纸条的特异性试验结果。
【具体实施方式】
[0021]下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0022]材料及试剂=DHAV-1H株尿囊液(Gene Bank登录号:JQ301467)，四川农业大学禽病防治中心提供；11日龄鸭胚，兔抗DHAV-1血清，四川农业大学禽病防治研究中心提供；氯仿，购自万科试剂公司；双抗，常规配制；PBS(pH7.4)缓冲液，常规配制并121°C高压灭菌；非免疫鸭阴性血清、鸭瘟病毒阳性血清、鸭传染性浆膜炎阳性血清、鸭沙门氏菌阳性血清、I型鸭甲肝病毒阳性血清及鸭大肠杆菌阳性血清，均由四川农业大学禽病防治研究中心保存；标记BSA及流动封闭BSA，购买于上海艾信生物科技有限公司；基于金标葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A，SPA)，羊抗兔IgG,购买于杭州纽龙生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)、玻璃纤维素膜、吸水纸、PVC底板、20nm胶体金溶液，购买于上海金标生物科技有限公司；金标复溶液:含3%蔗糖和5%海藻糖及1% BSA的0.2M Tris-HCl ;样品垫处理液:含3%蔗糖和1% BSA及0.5% Tween-20的0.2M Tris-HCl。
[0023]一、DHAV-1的增殖及纯化
[0024]UDHAV-1 的增殖
[0025]将实验室保存的含DHAV-1的尿囊液用无菌PBS做适当稀释后，添加双抗至终浓度为1%，37°C孵育30min，经尿囊腔接种于40枚9?11日龄鸭胚，0.2mL/枚，同时对另外五枚鸭胚，每枚注射0.2ml无菌PBS作为对照组。将上述鸭胚置于37°C孵化箱中孵化，每天观察胚胎生长状况，弃去24h内死亡的鸭胚，收集48?96h死亡的鸭胚，4°C保存过夜后收集尿囊液，-20 °C保存备用。
[0026]2、病毒的纯化
[0027]将收集到的死亡鸭胚的尿囊液反复冻融3次后于4°C、5000r/min离心30min，弃沉淀；将上清与等体积氯仿混合，反复震荡均匀，分装于离心管并4°C静置lh，然后4°C、5000r/min离心30min，取上清，如此反复作用2次；收集的上清在高速离心机中40000r/min离心3h，收集的沉淀加少量灭菌PBS溶解并小管分装，测浓度后于_70°C保存备用。Western blot结果表明纯化的DHAV-1可识别兔抗DHAV-1血清，表明其反应原性好。
[0028]二、DHAV-1抗体SPA胶体金免疫层析试纸条的制备方法及应用
[0029]1、检测DHAV-1抗体的胶体金免疫层析试纸条的制备
[0030]NC膜C线(质控线)、T线(测试线)的喷制:将纯化的DHAV-1和羊抗兔IgG用PB缓冲液(ΡΗ7.4)稀释后，分别划膜于NC膜上，2 μ 1/cm,分别形成T、C线，T、C线相距0.6cm,距NC膜的边缘0.2cm, 37 °C干燥过夜后密封保存。
[0031]胶体金标记SPA及金标垫的制备:取50ml的20nm胶体金溶液于清洗干净的250ml烧杯中，调PH，按每毫升金溶液逐滴加入35 μ g SPA,混合均匀后，加入10 % BSA至终浓度为1%，静置30min，4°C，8000r/min离心15min，加入1/10体积的金标复溶液，将其均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，4°C过夜冻干后密封保存。
[0032]试纸条的组装:分别将样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫依次粘在PVC塑料底板上，组装成型(如图1)，并切割成0.5cm宽的的试纸条，装于样品袋中，内置干燥剂密封保存于4Γ。
[0033]将纯化的DHAV-1包被于T线，羊抗兔IgG包被于C线，胶体金标记的SPA固化于金标垫上，当鸭血清中的鸭抗DHAV-1抗体流经金标垫时，与金垫上固化的胶体金标记的SPA结合形成“鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的SPA”复合物，该复合物继续流动，与T线上的DHAV-1抗原结合形成“DHAV-1-鸭抗DHAV-1抗体-胶体金标记的SPA”复合物，胶体金颗粒在T线上富集而呈现红色，且T线红色深浅与待检血清中抗体的含量成正比；而金垫上未与鸭抗DHAV-1抗体结合的金标SPA继续向前流动，与固化在C线上的羊抗兔IgG结合形成“胶体金标记的SPA-羊抗兔IgG”复合物，胶体金颗粒在C线富集而呈现出红色。因此，当向水平放置的试纸条上滴加约100 μ I待检血清时，在15min内观察反应结果，结果如图2所示，若出现C、T两条红线，则呈阳性，若只有C线呈红色，则为阴性结果，若C、T线均没有出现红色或只有T线出现红色，则表示试验失败。
[0034]2、胶体金免疫层析试纸条各条件优化
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